楊曉亮，楊曉波，師宏斌，張 強(qiáng)

環(huán)磷酰胺(CTX)在臨床腫瘤治療中的應(yīng)用越來越廣泛，如惡性淋巴瘤、肺癌、睪丸癌、卵巢癌以及其他自身免疫系統(tǒng)疾病等[1]。隨著CTX在臨床中的廣泛應(yīng)用，其對(duì)機(jī)體的副作用的相關(guān)報(bào)道也越來越多[2]。其中，CTX導(dǎo)致膀胱腫瘤的報(bào)道逐漸受到臨床及基礎(chǔ)研究者的關(guān)注[3]。然而，對(duì)于CTX可致膀胱腫瘤的發(fā)生機(jī)制目前鮮見報(bào)道,DNA的損傷是腫瘤發(fā)生的重要原因之一。因此，DNA損傷的修復(fù)機(jī)制為避免腫瘤的發(fā)生起到了關(guān)鍵作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷后核心組蛋白的化學(xué)修飾對(duì)于DNA的修復(fù)起到了重要作用。組蛋白(Histone)是真核細(xì)胞特有的蛋白質(zhì)，其包括H1、H2A、H2B、H3和H4五種。有研究報(bào)道，H2A組蛋白家族中包括H2A1、H2A2、H2AZ和H2AX，其中H2AX的含量在H2A中最少。然而，其在DNA損傷以及染色質(zhì)的代謝中發(fā)揮了重要的作用[6-7]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過對(duì)H2AX的檢測，探討其在CTX所致膀胱腫瘤的作用機(jī)制。

1資料與方法

1.1 一般資料：6周齡12只昆明SD大鼠，雄雌各半，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=6)和對(duì)照組(n=6)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SPF級(jí))提供。

1.2 主要試劑和儀器：環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，H2AX抗體、二抗等購自博士德生物有限公司，免疫組化試劑盒等購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，蛋白提取試劑盒購自凱基生物有限公司。

1.3 模型建立及標(biāo)本制備：實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg[8]，對(duì)照組給予相同劑量生理鹽水腹腔注射。正常飼養(yǎng)24 h后，給予烏拉坦麻醉致死量，在無菌低溫環(huán)境下剖腹取膀胱，在膀胱正中剖開，左側(cè)膀胱置于-80 ℃保存，右側(cè)膀胱用4%的多聚甲醛固定。

1.4 HE染色:60 ℃烤箱烤片4 h，二甲苯梯度脫蠟，無水乙醇梯度脫水，蘇木精/伊紅染色，無水乙醇梯度復(fù)水，中性樹膠封片。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測:60 ℃烤箱烤片4 h，二甲苯梯度脫蠟，無水乙醇梯度脫水，抗原修復(fù)，H2AX一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色。蘇木精復(fù)染、脫水、透明，中性樹膠封片。

1.6 蛋白印跡檢測:蛋白提取煮沸5 min，-80 ℃保存。用SDS-PAGE電泳，一抗孵育：將β-actin按1∶10 000比例稀釋，H2AX按1∶1 500比例稀釋，室溫?fù)u床孵育；二抗孵育：山羊抗兔二抗按1∶10 000稀釋，室溫?fù)u床孵育；滴加超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物、暗室曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 HE染色：與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠膀胱黏膜腫脹，表面粗糙，呈現(xiàn)斷續(xù)染色；對(duì)照組膀胱黏膜上皮細(xì)胞排列均勻，光滑，見圖1-圖2(目錄后)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色：H2AX蛋白在膀胱黏膜上皮細(xì)胞核表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組大鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞H2AX蛋白陽性表達(dá)少，見圖3-圖4(目錄后)。

2.3 蛋白印跡檢測：實(shí)驗(yàn)組H2AX蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=108.57,P<0.05)，見表1。

表1 2組大鼠熱應(yīng)激后pH2AX蛋白表達(dá)的比較

3討論

環(huán)磷酰胺(CTX)被用于多種疾病的治療。CTX是烷化劑類藥物以及細(xì)胞毒性免疫抑制藥物之一，作用效果很強(qiáng)。隨著CTX的廣泛應(yīng)用，其所導(dǎo)致膀胱腫瘤的病例不斷有報(bào)道[9]，而對(duì)于其導(dǎo)致膀胱腫瘤發(fā)生的機(jī)制鮮見報(bào)道。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生與DNA損傷的修復(fù)關(guān)系密切。機(jī)體受到外界不良刺激(毒性物質(zhì)、電離輻射等)時(shí)，DNA會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的損傷，機(jī)體識(shí)別DNA損傷后會(huì)啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)程序，而核心組蛋白在DNA損傷后的化學(xué)修飾修復(fù)中起到了關(guān)鍵性的作用[10-12]。組蛋白的磷酸化、乙?；约凹谆谡{(diào)控DNA損傷中發(fā)揮了重要作用。組蛋白是真核細(xì)胞染色質(zhì)的主要組成成分之一，包括H1、H2A、H2B、H3和H4五類，其中H2A主要參與DNA的修復(fù)，同時(shí)也參與細(xì)胞的分裂和細(xì)胞凋亡。組蛋白H2A又包括H2A1、H2A2、H2AZ和H2AX，其中H2AX雖然在H2A中含量最少，但其在DNA損傷的反應(yīng)及染色質(zhì)的代謝過程中發(fā)揮著重要的作用[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，H2AX基因C末端有一個(gè)高度保守的基因序列，當(dāng)外源性和內(nèi)源性因素使機(jī)體發(fā)生DNA損傷時(shí)，該序列上的139位氨基酸會(huì)被迅速磷酸化，被磷酸化的H2AX會(huì)激活更多的修復(fù)因子共同修復(fù)損傷的DNA，對(duì)基因組的穩(wěn)定和細(xì)胞周期的關(guān)卡有重要作用，進(jìn)而避免了腫瘤的發(fā)生[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，H2AX在大鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞中正常表達(dá)，說明大鼠膀胱黏膜上皮細(xì)胞存在DNA損傷后，H2AX迅速磷酸化進(jìn)而修復(fù)損傷DNA的能力。然而，在大鼠接受CTX處理后，膀胱黏膜上皮細(xì)胞H2AX出現(xiàn)顯著低表達(dá)，其不足以引起足夠H2AX磷酸化以修復(fù)損傷的DNA，因此可造成基因組的不穩(wěn)定以及細(xì)胞周期的紊亂，DNA損傷得不到足夠的修復(fù)，基因損傷隨著時(shí)間的推移不斷集聚，進(jìn)而有導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的可能。

綜上所述，大鼠經(jīng)CTX處理后膀胱黏膜H2AX蛋白表達(dá)降低，為CTX致膀胱腫瘤的發(fā)生提供了一定的理論基礎(chǔ)和研究思路。然而，疾病的發(fā)生是受多種因素影響的，其具體發(fā)生機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究，以期盡早探明環(huán)磷酰胺發(fā)生副作用的機(jī)制。