陳科諺，何海洪，柯娟玉，余蕙君，張立俊，王靜，周義文

南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院臨床檢驗醫(yī)學中心，廣東 深圳 518110

在死亡的相關原因中，癌癥是四大原因之一，而肝癌在全球中致死率位列第三，它嚴重危害著人類的身心健康[1-2]。更為突出的是，肝癌患者五年存活率不到10%，一年存活率低于50%[3]。近年來，肝癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，不僅預后差，而且容易發(fā)生癌癥的轉移[4-5]。有研究通過基因治療精準靶向定位殺傷腫瘤細胞，以及修正和替代病變基因，從而達到治療的效果[6-7]。

Survivin基因是一種存在于惡性腫瘤及胚胎組織中的獨特標記物[8]，Survivin 是一種凋亡抑制蛋白，基因位于常染色體17q25，大小約14.7 kb，含有4 個外顯子和3 個內顯子。Survivin 可抑制腫瘤細胞的凋亡、促進腫瘤細胞增殖分化和腫瘤血管生成。近年來，國內外多項研究均發(fā)現(xiàn)Survivin 基因的過度表達與多種腫瘤相關，包括胃癌、肝細胞癌以及頭頸部腫瘤，提示其可能作為一種新的腫瘤標志物而成為檢測惡性腫瘤的指標。而Survivin 的表達在很大程度上是從轉錄水平上來控制的，其主要通過位于Survivin 啟動子鄰近區(qū)域的細胞周期依賴性元件(cell cycle-dependent elements，CDEs)和細胞周期同源區(qū)域(cell cycle homology regions，CHRs)來調節(jié)。它在正常組織中不存在，但在調節(jié)細胞凋亡及細胞分裂中發(fā)揮著重要的作用，具有一定的安全選擇性，且在腫瘤基因的靶向治療中，起著很強的促進作用[9]。目前已有關于Survivin 信號通路誘導肝癌細胞的相關報道，但是Survivin 基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制并沒有明確。由于Survivin基因是目前發(fā)現(xiàn)的作用較強的凋亡抑制基因，而Survivin 基因與肝癌的發(fā)病及臨床病理特征具有一定的相關性，因此探討Survivin 基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制具有重要的意義。Survivin 不同于凋亡抑制蛋白家族的其他成員，其基因結構中含有很多個細胞凋亡的氨基酸殘基，這種結構能與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶直接或間接相結合，進而影響半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶與細胞凋亡存在著直接關系。因此，Survivin基因可作為靶向選擇的安全且特異腫瘤靶向治療基因，通過介導病毒載體攜帶基因導入靶細胞而達到抗腫瘤的治療效果[10]。

1 材料與方法

1.1 材料 Caspase-3染色試劑盒(BioVision)、肝癌HepG2細胞(中科院上海細胞庫)、AV-PI細胞凋亡檢測試劑盒(Invitrogen)、胎牛血清(Gibco)、MTT 細胞增殖試劑盒(Solarbio)、蛋白定量試劑盒(BOSTER)、轉染試劑盒(Invitrogen)、DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher)。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細胞的培養(yǎng) 肝癌HepG2 細胞種植于細胞培養(yǎng)瓶中，加入胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，進行細胞培養(yǎng)，用顯微鏡觀察，細胞生長達80%時，收集細胞。

1.2.2 慢病毒shRNA-Survivin 載體構建 吉凱基因有限公司合成提供了shRNA-Survivin 慢病毒載體以及表達的質粒，元件順序為pHBLV-U6-Zs-Green-PGK-Pu-ro，克隆位點為XhoI/BamHI。

1.2.3 肝癌細胞的分組 將肝癌HepG2 細胞分A組、B組、C組三個組。A組作為對照組，此組未經過任何處理。B 組為經過空白載體慢病毒轉染；C 組為經過shRNA-Survivin 載體慢病毒轉染。用熒光顯微鏡觀察經過ZsGreen 熒光探針標記后，細胞慢病毒轉染率。

1.2.4 檢測肝癌細胞增殖情況 將空白組、載體病毒組、shRNA-Survivin 慢病毒組三個組的細胞按照說明書要求接種，37℃孵育箱培養(yǎng)，4 d 后加MTT 溶液20 μL，搖床上晃動15 min后通過酶標儀檢測吸光度值。

1.2.5 檢測肝癌細胞AV-PI凋亡情況 將A組、B組、C 組三個組的細胞按照AV-PI 操作說明書進行檢測，通過流式細胞分析儀器來檢測三組細胞的凋亡變化情況。

1.2.6 檢測Caspase-3 的表達量 根據(jù)熒光定量PCR 試劑盒的說明書要求三組細胞融合率達80%后再經2.5 g/L 的胰蛋白酶消化，離心后，進行PCR 檢測預變性→變性→退火→延伸→終延伸，分別是94℃2 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃60 s，72℃5 min，25 個循環(huán)后計算目的基因的表達量。其中Survivin、Caspase-3、內參基因(GAPDH)引物由上海生物工程有限公司生產，見表1。

表1 目的引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞培養(yǎng) 肝癌HepG2 細胞在37℃孵育箱內進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)的細胞顯微鏡下觀察，待細胞生長達80%時，可見到HepG2 肝癌細胞生長良好，見圖1。

圖1 肝癌HepG2 細胞形態(tài)圖(100×)

2.2 慢病毒shRNA-Survivin 載體構建及轉染結果 ShRNA-Survivin 載體慢病毒轉染率為87%，以HepG2 肝癌細胞為靶點種子細胞轉染，成功構建了以熒光蛋白為熒光探針進行轉染，見圖2。

圖2 熒光蛋白構建的慢病毒shRNA-Survivin載體(200×)

2.3 各組細胞增殖能力比較 經吸光度測定結果顯示，A 組、B 組和C 組肝癌細胞轉染后，HepG2 肝癌細胞增殖率分別為(7.38±0.422)%、(8.99±0.382)%和(14.09±0.291)%，A 組、B 組的HepG2 肝癌細胞增殖率明顯低于C 組，差異均具有統(tǒng)計學意義(F=76.85，P＜0.05)。

2.4 各組細胞凋亡抑制率比較 各組數(shù)據(jù)顯示，A 組、B 組和C 組肝癌細胞凋亡抑制率分別為(4.56±1.37)%、(3.05±1.08)%和(39.45±12.88)%，A組、B組肝癌細胞凋亡抑制率明顯低于C組，差異均具有統(tǒng)計學意義(F=21.59，P＜0.05)。

2.5 各組肝癌HepG2細胞Survivin、Caspase-3的mRNA 相對表達量比較 經熒光定量PCR 檢測，A組、B 組和C 組中Survivin 基因相對表達量分別為0.938±0.049、0.979±0.068和0.488±0.085，A組、B組的Survivin 基因相對表達量明顯多于C 組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；A組、B組和C組在Caspase-3中的Survivin mRNA 表達量分別為0.938±0.041、0.983±0.057 和0.388±0.076，A 組、B 組在Caspase-3 中的Survivin mRNA表達量亦明顯多于C組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，然而其發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，但進展卻十分迅速，確診時大多數(shù)患者己屬于晚期或已發(fā)生了遠處轉移。同時原發(fā)性肝癌的治療也十分困難，預后也不是很好，自然生存時間很短，嚴重地威脅著人們的身體健康和生命安全?？焖賶堉呈歉伟┲匾纳飳W特點之一，肝癌的快速增殖是導致許多癌患者預后較差，5年生存率低的重要因素之一。因此，在我國研究肝癌的發(fā)病機制、生物學行為、診療、預后等顯得更為重要和迫切。

目前研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡失衡與腫瘤發(fā)病有關，而參與細胞凋亡調控的凋亡相關基因與腫瘤有顯著相的關性。Survivin參與疾病的發(fā)生與發(fā)展，是目前發(fā)現(xiàn)作用較強的凋亡抑制基因。在凋亡抑制蛋白家族中，它是分子量最小同時也是最強的凋亡抑制因子[11-12]。Survivin 在大多數(shù)腫瘤組織中都有一定的表達，并且與腫瘤的復發(fā)以及轉移等都有一定的關系[13]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Survivin 基因與肝癌也有很密切的相互關系[14-17]。因此，本研究旨在通過研究構建shRNA-Survivin 慢病毒載體，來探索Survivin 基因對肝癌細胞增殖、凋亡過程中的表達分析。原發(fā)性肝癌的Survivin基因發(fā)病機理尚不明確，且十分復雜，它的發(fā)生、發(fā)展和轉移與基因的多態(tài)性、信號轉導通路以及新生血管增生異常等有關，且存在多個關鍵性環(huán)節(jié)。因此，進行Survivin基因在肝癌細胞增殖、凋亡過程中的表達及意義的研究非常重要。

之前研究主要集中在癌基因、抑癌基因方面。目前研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡失衡與包括腫瘤在內的多種人類疾病有關。細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，是多細胞生物維持生長發(fā)育和組織形態(tài)所特有的，由多種基因參與表達、精密調控的細胞主動死亡過程，在維護多細胞生物的組織內穩(wěn)定性方面有著重要作用。凋亡的發(fā)生主要有兩條途徑：死亡受體介導的外部凋亡途徑和線粒體介導的內部凋亡途徑。細胞凋亡可分為兩大類：一是凋亡促進基因，起著促進凋亡作用。二是凋亡抑制基因，起著抑制凋亡的作用。這兩種凋亡涉及一系列相關基因的激活、表達以及調控，同時也存在一定的關聯(lián)。通常情況下細胞在沒有受到凋亡信號的刺激時，凋亡蛋白表達量是不會增加的，促凋亡與促生存蛋白之間的蛋白表達量處于相對的穩(wěn)態(tài)，只有細胞受到凋亡信號的刺激，兩種蛋白的表達平衡被打破，細胞才會走向凋亡。如果對凋亡機制得以進一步了解，將為腫瘤的治療開辟一個新的方向。因此，對于凋亡相關基因的研究具有很重要的意義。

Caspase-3 是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用。Survivin 基因是通過與Caspase-3 直接結合后，使抑癌基因磷酸化周期蛋白依賴性激酶4活化，從而阻止Procaspase-3的激活，進而參與調控細胞的病理生理過程。Survivin也可以對線粒體和死亡受體介導內源性細胞凋亡途徑產生強大的抑制作用，其作用方式主要是通過蛋白直接結合和抑制上下游Caspases 分子而發(fā)揮作用。Survivin基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制基因,主要是通過直接抑制Caspase級聯(lián)反應下游的終末子Caspase-3 的活性，從而發(fā)揮抗凋亡作用。Survivin 基因可通過加快腫瘤細胞由G1→S 期的轉換以及使腫瘤細胞在G2/M 期逃避對凋亡的識別，進而促進腫瘤細胞增殖、分化。Survivin 基因能通過血管形成因子(VEGF、bFGF、Ang-1和COX-2)在血管形成的中間環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。

因為Survivin 可抑制腫瘤細胞的凋亡、促進腫瘤細胞增殖分化和腫瘤血管生成，提示其可能作為一種新的腫瘤標志物，成為檢測惡性腫瘤的指標。通過Survivin 基因與中國人群腫瘤易感性的分析，進而研究Survivin 基因與中國人群肝癌細胞的關系。

半胱氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3)與ICE/CED-3 具有同源活性中心的序列，它是存在于胞質溶膠結構中的一種酶。Caspases 的共同特點是都含有半胱氨酸。本研究通過熒光定量PCR (RT-qPCR)方法檢測空白組、載體病毒組、shRNA-Survivin 慢病毒組Survivin mRNA 的相對表達水平以及這三個組在Caspase-3的Survivin mRNA 的相對表達水平，發(fā)現(xiàn)當Caspase-3活性升高時，Survivin 蛋白及mRNA 的表達會明顯降低，并且細胞的凋亡比率上升同時結構發(fā)生典型凋亡改變，與此同時微絲形態(tài)結構在細胞內也遭到了破壞。這就證明了轉染后的肝癌細胞降低了細胞內Survivin 基因的表達并激活了Caspase-3，進一步通過活化的Caspase-3，從而破壞細胞骨架和微絲系統(tǒng)結構，導致細胞的凋亡，可見shRNA-Survivin 對肝癌細胞具有抑制增殖和促進凋亡的調節(jié)作用，可以抑制Survivin基因的表達。因此，Survivin 基因在肝癌組織中的表達含量與該腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預后評估和治療效果密切相關。

本研究結果有助于指導原發(fā)性肝癌的早期篩查和預防，提前預知可能發(fā)生肝癌的預先評估和診斷時機。所以在未患肝癌時，提前篩查Survivin 基因對肝癌易感人群的診斷開辟了一個令人興奮的新途徑。傳統(tǒng)肝癌的篩查主要結合臨床癥狀、生化指標AFP、B超等手段進行檢測，但常常發(fā)現(xiàn)肝癌時已經是晚期，而Survivin 基因的研究對于未患肝癌的易感人群來說，卻可能起到提前預知、提前預測肝癌的發(fā)病概率，提前篩查出可能會有肝癌的風險系數(shù)的作用。由于肝癌與遺傳因素、環(huán)境因素、生活習慣、飲食習慣有很大關系，因此通過早期篩查Survivin 基因可能對提前制定預防原發(fā)性肝癌的個體化相關方案、提前采取相應的預防措施起到重要作用。