孫懷霞，王令臣，林鄭忠，洪誠毅，黃志勇

(集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

氯霉素(chloramphenicol,CAP)屬抑菌性廣譜抗生素，曾被用于漁業(yè)和畜牧業(yè)[1-2]。但是，長期攝入含CAP的食物會對人體產(chǎn)生骨髓抑制、再生性貧血及“灰色嬰兒綜合癥”等危害[3-4]。因此，歐盟規(guī)定，動物源食品中CAP不得檢出。2007年，我國農(nóng)業(yè)部也宣布在獸醫(yī)學(xué)中禁止使用CAP[5]。因此，對CAP殘留的檢測至關(guān)重要。目前，CAP檢測方法有色譜法[6-9]、表面增強(qiáng)拉曼散射法[10]、分子印跡法[11]、化學(xué)發(fā)光芯片免疫法[12]、量子點修飾的電化學(xué)方法[13]、直接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[14]等。但這些方法由于操作繁瑣且耗時，儀器設(shè)備昂貴且還需要專業(yè)人員操作[15]。因此，建立一種快速、簡便的CAP檢測方法具有實際意義。

核酸適配體是通過體外配體指數(shù)級富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)從人工構(gòu)建的寡核苷酸文庫中篩選出來的單鏈寡核苷酸序列[16]，具有結(jié)合范圍廣、成本低、毒性小和易于合成修飾[17]等優(yōu)點，已應(yīng)用于多種傳感檢測中，如電化學(xué)[18]、金納米粒子[19]、石墨烯材料[20-21]、熒光[22]和電化學(xué)發(fā)光[23]等。但是這些方法存在一些不足，例如熒光檢測實際樣品時背景熒光干擾嚴(yán)重，容易導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性[22]；電化學(xué)及電化學(xué)發(fā)光法需要對電極進(jìn)行設(shè)計，可能會降低識別能力，檢測性能的穩(wěn)定性難以保證[24]；石墨烯和金納米粒子結(jié)合適配體檢測方法制備可用的金納米粒子處理較為繁瑣，限制了其大規(guī)模應(yīng)用[21]。因此，需要開發(fā)一種靈敏、簡便的適配體方法檢測CAP。

氯化血紅素(hemin)是許多天然酶重要的催化輔助因子，已被用于構(gòu)建多種生物檢測方法[25]，其中包括具有過氧化物酶性質(zhì)的G-四鏈體/hemin酶[26]和hemin-還原石墨烯-金復(fù)合材料的設(shè)計[27]。此外，由于hemin在水溶液中溶解性較差，易聚集成低催化活性的hemin二聚體，將其修飾在DNA上可顯著提高其溶解度，維持其單體結(jié)構(gòu)以保持較高的催化活性[28]。

本文設(shè)計了一種基于適配體和hemin的比色方法，可用于快速檢測牛奶中的CAP含量。此方法以hemin為過氧化物模擬酶，通過調(diào)節(jié)其對四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)的氧化催化活性實現(xiàn)對CAP的定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hemin-核酸適配體[29]序列為5′-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-hemin-3′，hemin-cDNA序列為5′-hemin-CTACCACCGACTCGC-3′，購自上海生工生物技術(shù)有限公司；CAP、四環(huán)素(tetracycline,TC)、土霉素(oxytetracycline,OTC)、金霉素(chlorotetracycline,CTC)、磺胺(sulfonic acid,SA)和TMB均購自百靈威科技有限公司；過氧化氫和氯化鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·12H2O)、二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)和三水合乙酸鈉(NaAc·3H2O)購自西隴化工股份有限公司。DNA儲備液介質(zhì)是磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.0，100 mmol/L NaH2PO4，100 mmol/L Na2HPO4)。反應(yīng)緩沖液為HAc-NaAc(pH= 4.0，50 mmol/L HAc-NaAc，100 mmol/L NaCl)。反應(yīng)終止液為2 mol H2SO4。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax plus 384型酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；PDA UV/VIS Lambda 265型紫外分光光度計，美國PerkinElmer公司；arium bagtank 50水純化系統(tǒng)，德國賽多利斯公司。

1.3 樣品預(yù)處理

牛奶樣品購自當(dāng)?shù)爻?，并在分析前進(jìn)行預(yù)處理。稱取牛奶試樣約2 g于10 mL離心管中，加4 mL乙腈，振蕩充分，13 000 r/min離心10 min，提取液置于離心管中，氮?dú)獯蹈?。再? mL PBS溶解，加2 mL環(huán)己烷，充分振蕩后于13 000 r/min 離心10 min，棄上層(即正己烷層)以除去脂肪，取下層水相過膜后進(jìn)樣分析[30-31]。

1.4 CAP檢測

將兩條DNA鏈在90 ℃退火10 min，在100 mmol/L PBS緩沖液中將等體積4 μmol/L的hemin-aptamer和hemin-cDNA溶液于室溫下混合反應(yīng)20 min，獲得2 μmol/L的雙鏈DNA。取20 μL雙鏈DNA與不同濃度CAP于25 ℃孵育1 h，向其中加入TMB、H2O2和緩沖液至總體積為200 μL。由于TMB氧化顯色時間較長，難以達(dá)到穩(wěn)定，因此，將反應(yīng)溶液于25 ℃孵育15 min后立即加入50 μL H2SO4溶液(2 mol/L)以終止反應(yīng)，加入H2SO4后溶液顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，最大吸收波長由652 nm 轉(zhuǎn)變?yōu)?52 nm，記錄452 nm處溶液的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

此方法引入兩條hemin單體修飾的DNA鏈，在檢測體系中無CAP時，兩條DNA單鏈由于互補(bǔ)雜交形成DNA雙鏈，由于修飾在單鏈上的hemin單體相互靠近形成二聚體，使其過氧化物酶活性降低。而當(dāng)體系中有CAP時，由于CAP與核酸適配體特異性結(jié)合，導(dǎo)致DNA雙鏈解離，hemin二聚體解聚成單體，過氧化物酶活性恢復(fù)，可有效催化H2O2氧化TMB，生成藍(lán)色氧化物，由溶液顏色深淺的變化可判斷CAP的含量，通過記錄452 nm處的吸光度值，實現(xiàn)CAP定量分析。

2.2 實驗可行性

如圖1所示，hemin單體(曲線a)在402 nm處顯示出吸收峰，修飾hemin的單鏈DNA(曲線b)在260 nm處顯示出DNA吸收峰和hemin單體吸收峰；而由適配體和互補(bǔ)鏈形成的DNA雙鏈(曲線c)在378 nm處出現(xiàn)一個新的吸收峰，此吸收峰為hemin二聚體的吸收峰，表明成功合成了DNA雙鏈。如圖2所示，當(dāng)體系中無CAP存在時(曲線a)的吸光度值比有CAP存在時的(曲線b、c)低。同時，高濃度CAP(30 nmol/L) 所產(chǎn)生的吸光度值比低濃度CAP(5 nmol/L) 所產(chǎn)生的吸光度值大，表明所建立的方法可有效檢測CAP。

2.3 條件優(yōu)化

實驗對hemin修飾的DNA濃度、緩沖體系的種類、緩沖液中Na+濃度、pH、TMB和H2O2的濃度分別進(jìn)行了優(yōu)化。考察1～5 μmol/L hemin修飾的DNA濃度對實驗的影響，發(fā)現(xiàn)DNA濃度越大，信號的吸光度值越大，但濃度為2 μmol/L時信號的吸光度值就可滿足檢測要求。為了節(jié)約成本，選擇hemin修飾的DNA濃度皆為2 μmol/L。實驗還考察了PBS、NaAc-HAc和4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖體系對實驗的影響發(fā)現(xiàn)，在NaAc-HAc緩沖液中，TMB被氧化顯色較理想，因此選擇緩沖液為NaAc-HAc。還對NaAc-HAc緩沖液中Na+濃度(50～200 mmol/L)進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)Na+濃度小于100 mmol/L時，DNA雙鏈結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；而Na+濃度太高時，雙鏈結(jié)合牢固，使得CAP很難與適配體結(jié)合。因此選擇Na+濃度為100 mmol/L。

NaAc-HAc緩沖液的pH值優(yōu)化結(jié)果如圖3a所示，緩沖液pH值越大，反應(yīng)溶液的吸光度值越小，而在pH=4.0時，吸光度值最大?？赡茉蚴窃诖藯l件下，TMB被催化氧化更徹底。因此，緩沖液的pH值選擇4.0。TMB濃度對CAP檢測的影響如圖3b所示，TMB濃度越大，溶液吸光度值越大，而當(dāng)TMB濃度高于0.9 mmol/L時，溶液的吸光度值開始減小，這可能是TMB 在水溶液中溶解度較低，在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)溶液的吸光度值隨TMB濃度增大而增大，而TMB過量時不能充分溶解，導(dǎo)致其吸光度值減小。因此，實驗選擇TMB的濃度為0.9 mmol/L。圖3c為H2O2濃度對CAP檢測的影響，隨著H2O2濃度從60 mmol/L增加到140 mmol/L，溶液的吸光度值先增大后減小，當(dāng)H2O2濃度為100 mmol/L時，溶液的吸光度值最大。因此，選擇H2O2濃度為100 mmol/L。

2.4 線性關(guān)系

實驗考察了1～30 nmol/L范圍內(nèi)CAP濃度與溶液吸光度值的響應(yīng)關(guān)系，如圖4a所示，隨著CAP濃度增加，溶液在452 nm處的吸光度值也逐漸增加。圖4b表明，CAP在1～30 nmol/L范圍內(nèi)，吸光度值與CAP濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.019 9x+1.223，相關(guān)系數(shù)R2=0.976，檢出限為0.315 nmol/L(3σ，n=9)。

如表1 所示，與色譜法、表面增強(qiáng)拉曼散射法、直接競爭ELISA法、分子印跡法、化學(xué)發(fā)光免疫以及其他基于適配體的檢測方法相比，本方法具有較低的檢測限，線性范圍較寬，實驗過程也較為簡便快速，可用于痕量CAP的檢測。

表1 本方法與其他CAP檢測方法的比較

2.5 選擇性和干擾

為了分析所建立的方法對CAP的選擇性，實驗選取TC、OTC、CTC和SA等常見抗生素，考察其對探針的響應(yīng)程度。將CAP濃度設(shè)為30 nmol/L，而其他抗生素的濃度均為60 nmol/L。圖5的結(jié)果表明，除了CAP，其他抗生素的信號響應(yīng)都較低。而當(dāng)加入CAP時，吸光度值增大，說明此方法對CAP檢測有良好的選擇性。將其他抗生素與CAP混合且濃度均設(shè)為30 nmol/L，混合液的吸光度值與單獨(dú)檢測CAP的吸光度值相近，表明其他物質(zhì)對CAP的檢測沒有產(chǎn)生明顯的干擾。

2.6 實際樣品檢測

為了考察此方法在實際樣品中檢測CAP的性能，實驗選取了市售牛奶樣品進(jìn)行試驗，結(jié)果未檢出。對該樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，選取4個加標(biāo)水平，每個水平平行3份，結(jié)果如表2所示，牛奶樣品中CAP的加標(biāo)回收率為95.5%～116.0%，表明該方法可用于牛奶樣品中CAP的檢測。

表2 牛奶樣品中CAP的回收率

3 結(jié)論

通過加入CAP可調(diào)節(jié)修飾在DNA鏈中的氯化血紅素的過氧化物酶活性，進(jìn)而通過酶催化TMB與H2O2的氧化反應(yīng)快速檢測CAP。在優(yōu)化條件下，CAP檢測的線性范圍為1～30 nmol/L，檢測限為0.315 nmol/L，在牛奶樣品中的加標(biāo)回收率為95.5%～116.0%，表明所建立的方法快速、準(zhǔn)確。