高少陽，王明偉，張 盛，岳君秋，常 青

術中快速病理診斷是輔助臨床醫(yī)師在術中明確腫瘤良惡性、決定手術方式的重要手段，病理切片經(jīng)HE染色在鏡下觀察細胞形態(tài)、組織學特征，并進行快速診斷。由于HE染色切片因其自身局限性、制片過程中造成假象等可能導致誤診，難以確診疑難病例，有較大的醫(yī)療風險。術中對冷凍切片進行快速免疫組化染色，可提高術中快速病理診斷的準確性。目前，文獻報道的術中快速病理診斷在技術步驟、效果、時長、成本等各有優(yōu)缺點[1-3]。本科室在實踐工作中建立快速手工免疫組化檢測體系，用于術中輔助診斷疑難病例，取得良好效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集16例冷凍切片(經(jīng)HE染色難以確診的疑難病例)，其中10例乳腺導管原位癌伴/不伴微小浸潤，3例乳腺硬化性腺病，3例低分化癌。另收集2例乳腺纖維腺瘤作為對照，留取組織標本或切片進行術中快速免疫組化染色。

1.2 試劑(1)實驗室自配AAF固定液(95%乙醇85 mL、甲醛10 mL、乙酸5 mL)，PBS緩沖液(pH 7.3，北京中杉金橋公司)。(2)快速免疫組化一抗和石蠟切片免疫組化一抗試劑詳見表1、2。二抗顯色系統(tǒng)采用EnVision FLEX酶標二抗及DAB工作液；p63、CKpan采用Leica BOND-MAX全自動免疫組化儀進行染色，二抗及顯色系統(tǒng)為Leica Bond顯色試劑套裝；Calponin采用DAKO自動染色機Link48和EnVision FLEX檢測系統(tǒng)進行染色。

1.3 主要儀器全自動免疫組化儀BOND-MAX/Leica，Autostainer Link48/DAKO等。

1.4 方法

1.4.1術中快速手工免疫組化 (1)新鮮組織于-20 ℃速凍后4～6 μm厚切片，固定液(AAF或冷丙酮)固定1 min，經(jīng)PBS沖洗5 s，丙酮固定組織室溫晾干5～10 s；(2)滴加一抗于37 ℃孵育5 min，PBS沖洗5 s×3次；(3)滴加酶標二抗試劑37 ℃孵育5 min，PBS沖洗5 s×3次；(4)DAB顯色37 ℃ 1 min，水洗5 s；(5)蘇木精復染8～10 s，水洗5 s；(6)梯度脫水，封固。

表1 術中快速免疫組化一抗試劑

表2 石蠟切片免疫組化一抗試劑

1.4.2術后石蠟切片全自動免疫組化 術中快速制片的組織以及剩余組織再取材，均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，梯度脫水、透明浸蠟、石蠟包埋、制片、脫蠟、高壓修復后，行免疫組化EnVision法染色，具體染色步驟按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 不同固定液的比較本實驗選用術中新鮮取材的乳腺導管原位癌組織行p63和Calponin檢測，選用低分化癌組織進行CKpan檢測；同一組織切片后分別用AAF和冷丙酮進行固定，再行免疫組化EnVision法染色。結果顯示：兩組切片中p63(圖1)、Calponin和CKpan均陽性，而冷丙酮固定組陽性強度更高。

2.2 一抗?jié)舛鹊谋容^本實驗選用術中快速送檢的不同組織進行一抗?jié)舛忍荻葘嶒灒喝橄儆不韵俨?p63，1 ∶150～1 ∶300)，乳腺纖維腺瘤(Calponin，1 ∶100～1 ∶400)和低分化癌(CKpan，1 ∶50～1 ∶400)。結果表明：濃度較高組信號強度更有利于判讀(圖2)，但需注意觀察組織內(nèi)陰性區(qū)域是否明確，避免一抗?jié)舛冗^高導致的假陽性。

2.3 快速免疫組化和石蠟切片免疫組化分析使用優(yōu)化的術中快速免疫組化染色技術，對新鮮冷凍切片進行p63、Calponin和CKpan染色，結果表明：p63、Calponin對肌上皮的標記和CKpan對低分化癌的標記均定位較明確，術中快速免疫組化和術后石蠟切片的免疫組化結果一致。

圖1 A.AAF固定組：乳腺導管內(nèi)癌組織中p63呈陽性，EnVision法;B.丙酮固定組：乳腺導管內(nèi)癌組織中p63呈陽性，EnVision法 圖2 A.冷凍切片：胸膜低分化癌中CKpan(1 ∶50稀釋組)染色，EnVision法;B.冷凍切片：胸膜低分化癌中CKpan(1 ∶400稀釋組)染色，EnVision法

3 討論

3.1 術中快速免疫組化注意事項(1)固定液的使用：本實驗發(fā)現(xiàn)冷丙酮固定的冷凍切片顯色度最強，與冷丙酮滲透力強[4-5]、抗原保護作用強有關。另外其與組織溫差較小，滴加到組織上進行固定，可以更好的保護抗原，效果優(yōu)于AAF固定液。丙酮還具有快速揮發(fā)特點，可以快速晾干切片，無需PBS溶液沖洗可提高一抗的孵育濃度，并節(jié)省實驗時間。(2)免疫組化操作：孵育溫度、抗體濃度、足量的抗體覆蓋是實驗成功的關鍵。由于快速免疫組化抗體孵育時間僅為5 min(常規(guī)石蠟切片孵育時間為1～1.5 h)，因此孵育溫度必須盡快達37 ℃，并在孵育過程中保證溫度穩(wěn)定，通常將濕盒預先在37 ℃孵箱中預熱，并在孵育過程中輕輕震蕩混勻。一抗?jié)舛刃韪哂诔Ｒ?guī)石蠟切片的一抗?jié)舛?，根?jù)檢測指標表達的不同，快速免疫組化一抗?jié)舛壬踔烈_到常規(guī)使用濃度的5～10倍。另外，需保證滴加試劑的量完全覆蓋切片的組織為宜，一般需要150～200 μL。因為抗體濃度對陽性強度影響較大，滴加一、二抗試劑前應將PBS沖洗液盡量吸干，以避免抗體試劑被稀釋造成染色不佳或不著色。一抗需要選擇適用于冷凍切片的抗體，個別實驗抗體僅適用于石蠟切片，用于冷凍切片則顯示實驗失敗，實驗前需進行預實驗來確定最佳固定液及抗體濃度。

3.2 術中快速免疫組化的優(yōu)缺點分析本組優(yōu)化后的實驗方法不需要準備特殊的抗體及其它化學試劑和設備，在日常的術中快速病理診斷過程中，可以根據(jù)組織來源并結合HE形態(tài)，挑選1～2種抗體進行快速免疫組化染色，染色耗時約15 min。個別脂肪含量高難以切片或要求定點切疑似浸潤區(qū)域的組織，可以先與手術醫(yī)師溝通，告知初步結果，再行術中快速免疫組化檢測。

術中快速免疫組化染色也存在缺陷[6]：術中冷凍組織由于未經(jīng)脫水、浸蠟等步驟，各組織成分軟硬程度不一，影響切片完整度；切片過程中由于緩慢凍結或者冷凍時間過長等原因，易造成組織細胞內(nèi)外冰晶及核內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，進而導致抗原彌散，影響陽性定位和后續(xù)判讀；貼片后不能進行烤片，組織和玻片之間貼合僅靠溫差作用和部分電荷作用，組織切片在后續(xù)15 min的持續(xù)浸泡、沖洗過程中也容易造成組織脫片、彌散等現(xiàn)象，在實驗過程中需要克服以上難點。