張 亮，馬志園，李 慢，周新剛，陳佳敏，王 鵬

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)是2019年新出現(xiàn)的急性呼吸道傳染病，臨床表現(xiàn)輕重不一。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)傳染性極強(qiáng)，人群普遍易感[1]。目前，我國(guó)已將該病納入中華人民共和國(guó)傳染病防治法規(guī)定的乙類(lèi)傳染病，因其具有較強(qiáng)的傳染性，故采取甲類(lèi)傳染病的預(yù)防和控制措施。對(duì)于重癥的COVID-19患者，支氣管鏡技術(shù)可以清除痰液、改善通氣、糾正缺氧，還可以獲取肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagr fluid, BALF)，進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)分析，明確有無(wú)特殊感染，為臨床治療提供重要依據(jù)[2]。但是BALF的細(xì)胞學(xué)涂片常因細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不典型、細(xì)胞蛻變以及不能進(jìn)行免疫組化檢測(cè)等導(dǎo)致診斷的局限性。通過(guò)制作細(xì)胞蠟塊、完善特殊染色及免疫組化檢測(cè)可使病理診斷更精準(zhǔn)化。但是COVID-19患者的BALF具有較強(qiáng)的傳染性，需要在標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)及制作過(guò)程中采取科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆雷o(hù)措施。本實(shí)驗(yàn)對(duì)原有標(biāo)本的轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞蠟塊制作方法進(jìn)行優(yōu)化，避免發(fā)生實(shí)驗(yàn)室人員感染，保障COVID-19患者細(xì)胞蠟塊制作的安全完成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源 2020年2～5月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房收治的14例COVID-19患者BALF標(biāo)本。

1.1.2主要試劑 10%中性福爾馬林、HE染液購(gòu)自北京益利公司，AB-PAS染液購(gòu)自廣州安必平公司，CK、二抗顯色系統(tǒng)購(gòu)自Leica公司。

1.1.3主要儀器 Thermo Excelsior ES 脫水機(jī)，Leica ST5020染色機(jī)，Leica Bond全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)。

1.2 方法

1.2.1防護(hù)方法 一級(jí)防護(hù)，穿工作服、工作鞋，戴醫(yī)用帽子、外科口罩、乳膠手套；二級(jí)防護(hù)，穿工作服、隔離衣、鞋套、戴N95口罩、乳膠手套、醫(yī)用帽子；三級(jí)防護(hù)，在二級(jí)防護(hù)的基礎(chǔ)上穿連體防護(hù)服，佩戴護(hù)目鏡或面罩。

1.2.2標(biāo)本采集 檢查人員參照三級(jí)防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，患者局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過(guò)口或鼻經(jīng)過(guò)咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支氣管，將其頂端契入支氣管分支開(kāi)口，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水進(jìn)行灌洗，并取樣放置于無(wú)菌保存瓶中。

1.2.3標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn) 用75%乙醇對(duì)保存瓶噴霧消毒后放入帶有生物安全標(biāo)識(shí)的密封袋中；用75%乙醇對(duì)密封袋噴霧消毒，將密封袋放入轉(zhuǎn)運(yùn)桶內(nèi)，防止保存瓶倒立、傾斜；用75%乙醇對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)桶噴霧消毒，將轉(zhuǎn)運(yùn)桶放入生物安全轉(zhuǎn)運(yùn)箱內(nèi)；用75%乙醇對(duì)生物安全轉(zhuǎn)運(yùn)箱噴霧消毒。轉(zhuǎn)運(yùn)人員穿工作服將標(biāo)本經(jīng)指定路線送至P2+實(shí)驗(yàn)室(加強(qiáng)型二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室)。

1.2.4BALF前處理 操作人員參照三級(jí)防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，在生物安全柜內(nèi)檢查標(biāo)本有無(wú)泄露并核對(duì)患者信息。將采集的BALF放入水浴鍋中，56 ℃滅活30 min后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管內(nèi)，3 000 r/min離心5 min，將上清液倒入廢液桶內(nèi)，加入20 mL 10%中性福爾馬林，固定2 h以上。參照標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)方法，將固定后的BALF轉(zhuǎn)運(yùn)至病理科。

1.2.5病理科接收 接收人員參照二級(jí)防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，用75%乙醇對(duì)生物安全轉(zhuǎn)運(yùn)箱、轉(zhuǎn)運(yùn)桶、密封袋、離心管依次噴霧消毒后取出。

1.2.6細(xì)胞蠟塊制作 操作人員參照二級(jí)防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)將固定后的BALF以3 000 r/min離心5 min，將上清液倒入廢液桶內(nèi)，加入正常人血漿200 μL、95%乙醇5 mL，使用震蕩儀器，將液體與沉淀物充分混勻，靜置15 min后，3 000 r/min離心5 min，棄掉上清液至廢液桶內(nèi)，輕輕敲擊離心管管壁，使凝固成塊的細(xì)胞團(tuán)從離心管底脫落，用包埋紙打包放入包埋盒中，置入脫水機(jī)中參照小標(biāo)本處理程序過(guò)夜，次日包埋成蠟塊。

1.2.7切片及染色 參照一級(jí)防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，在常規(guī)技術(shù)室進(jìn)行4 μm厚連續(xù)切片3張，行HE染色(采用Leica ST5020染色機(jī))、AB-PAS染色(嚴(yán)格遵守試劑盒說(shuō)明書(shū)操作流程)、免疫組化CK染色(采用Leica Bond全自動(dòng)免疫組化染色機(jī))。

1.2.8醫(yī)療廢物處理 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢液采用550 mg/L的有效氯浸泡，作用時(shí)間60 min以上，其它固體廢物和防護(hù)用品視為高危醫(yī)療廢物，放入專(zhuān)用黃色垃圾袋，并注明“新冠高危醫(yī)療廢物”標(biāo)識(shí)，密封交至后勤工作人員，根據(jù)《醫(yī)療廢物處理?xiàng)l例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行處置和管理。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室安全本實(shí)驗(yàn)于56 ℃下對(duì)BALF滅活30 min，再采用10%中性福爾馬林處理，在生物安全二級(jí)防護(hù)措施下進(jìn)行細(xì)胞蠟塊制作，未發(fā)生實(shí)驗(yàn)室人員感染。

2.2 細(xì)胞數(shù)量鏡下觀察12例細(xì)胞量豐富(圖1)，2例細(xì)胞量較少，僅在邊緣有少量細(xì)胞存在(圖2)。

2.3 形態(tài)學(xué)染色HE染色，薄厚均勻，細(xì)胞無(wú)變形，核質(zhì)對(duì)比清晰；AB-PAS染色顯示酸性黏液呈藍(lán)色(圖3)；免疫組化染色CK顯示上皮細(xì)胞陽(yáng)性(圖4)。

圖1 黏液背景下可見(jiàn)少量呼吸上皮細(xì)胞及炎細(xì)胞 圖2 細(xì)胞蠟塊，僅在邊緣有少量細(xì)胞存在 圖3 酸性黏液呈藍(lán)色，AB-PAS染色 圖4 CK染色顯示呼吸上皮細(xì)胞陽(yáng)性，EnVision法

3 討論

SARS-CoV-2屬于β屬的冠狀病毒，基因特征與SARSr-CoV和MERSr-CoV有明顯區(qū)別，其傳播途徑主要包括飛沫、接觸、空氣傳播，氣溶膠傳播是實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的傳播方式。病毒對(duì)紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過(guò)氧乙酸和氯仿等脂溶劑，均可有效滅活病毒[3]。目前，研究發(fā)現(xiàn)重型COVID-19患者白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和降鈣素原水平明顯高于普通型患者，提示患者可以合并特殊感染[4]。

細(xì)胞蠟塊技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于胸、腹水等制作，已經(jīng)證實(shí)其相對(duì)于傳統(tǒng)涂片具有更高的病理診斷價(jià)值[5-6]，但COVID-19患者等具有高傳染性體液標(biāo)本的細(xì)胞蠟塊制作流程尚未有報(bào)道。作者在標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)及接收時(shí)，采用三層包裝，并逐層用75%乙醇進(jìn)行噴霧消毒，降低病毒暴露風(fēng)險(xiǎn)；在P2+實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，首先將BALF標(biāo)本放入水浴鍋中56 ℃滅活30 min，然后通過(guò)離心獲取細(xì)胞濃縮液，加入10%中性福爾馬林，在保持細(xì)胞原有結(jié)構(gòu)的同時(shí)可以增強(qiáng)對(duì)病毒的滅活作用；為避免紙質(zhì)接觸傳染，采用電子病理申請(qǐng)單及電子病理報(bào)告，避免紙質(zhì)在手術(shù)室、隔離病區(qū)、病理科傳播，降低接觸傳播的幾率。經(jīng)過(guò)以上措施進(jìn)行細(xì)胞蠟塊制作，未發(fā)生實(shí)驗(yàn)室人員感染。

在細(xì)胞蠟塊的制作過(guò)程中，因血漿中含有豐富蛋白，與乙醇混合后可發(fā)生凝固，使細(xì)胞凝聚成團(tuán)塊[7]，脫水機(jī)處理后包埋成蠟塊，對(duì)蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片和染色，鏡下觀察細(xì)胞量豐富，細(xì)胞無(wú)變形，核質(zhì)對(duì)比清晰，特殊染色及免疫組化定位準(zhǔn)確，陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)，且無(wú)非特異性著色。其中2例BALF肉眼可見(jiàn)其呈透明樣，鏡下觀察細(xì)胞量較少，對(duì)于此類(lèi)標(biāo)本，可采用50 mL離心管離心后，取濃縮液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，加入100 μL正常人血漿及100 μL 95%乙醇，3 000 r/min離心5 min，再繼續(xù)蠟塊制作，可增加細(xì)胞數(shù)量。

相對(duì)于傳統(tǒng)涂片，細(xì)胞蠟塊可以永久保存，重復(fù)制片，進(jìn)行特殊染色、免疫組化、分子檢測(cè)等有助于提高病理診斷的精準(zhǔn)性，同時(shí)易于進(jìn)行回顧性分析。COVID-19患者的BALF因具有較強(qiáng)的傳染性，在操作過(guò)程中，每個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)嚴(yán)格遵循生物安全防控制度，同時(shí)科室應(yīng)對(duì)全員進(jìn)行防護(hù)培訓(xùn)，對(duì)重點(diǎn)崗位的實(shí)驗(yàn)人員重點(diǎn)培訓(xùn)，使其熟練掌握COVID-19的防控知識(shí)、方法與技能，避免在細(xì)胞蠟塊制作過(guò)程中發(fā)生院內(nèi)感染。因此，對(duì)于類(lèi)似高傳染性體液標(biāo)本的轉(zhuǎn)運(yùn)及制片，本實(shí)驗(yàn)均具有借鑒意義。