曹嵐嵐,程雪梅,楊立國,王秀蘭,奧·烏力吉,王長虹
蒙藥砂藍刺頭定性與定量質量控制方法研究
曹嵐嵐1,程雪梅1,楊立國2,王秀蘭2,奧·烏力吉2,王長虹1*
1. 上海中醫(yī)藥大學中藥研究所,中藥標準化教育部重點實驗室,上海市復方中藥重點實驗室,上海中藥標準化研究中心,上海 201203 2. 內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院,蒙藥研發(fā)國家地方聯合工程研究中心,內蒙古 通遼 028000
建立砂藍刺頭的質量控制方法。采用薄層色譜法,以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶1∶1∶0.8)為展開劑對砂藍刺頭花中1-甲基-4-甲氧基-8-(β--葡萄吡喃型糖苷)-2(1H)-喹啉酮(MMQ)進行定性鑒別;建立砂藍刺頭HPLC指紋圖譜,并對MMQ的含量測定方法進行研究。建立的TLC方法對照品斑點清晰,分離度好;建立的指紋圖譜分析方法能夠區(qū)分砂藍刺頭與近源植物,標定了8個特征峰,并指認出其中4個成分。定量方法測定結果顯示MMQ在2.024~151.800 μg/mL呈良好線性關系,平均加樣回收率為101.54%,RSD為1.46%。7批樣品中MMQ的質量分數為0.13%~0.53%。建立的質量控制方法科學、可靠,可為砂藍刺頭質量標準的建立提供實驗依據。
砂藍刺頭花;質量控制;薄層色譜法;高效液相色譜法;1-甲基-4-甲氧基-8-(β--葡萄吡喃型糖苷)-2(1)-喹啉酮
菊科藍刺頭屬L.植物在全世界有120余種[1],分布于南歐、北非和中亞。我國有19種,主要分布于我國東北、華北及西北地區(qū)[2-3]。藍刺頭屬植物中含有有機酸類[4]、噻吩類[5]、黃酮類[6]和生物堿類[7]等化學成分。該屬植物多數有藥用價值,在我國中醫(yī)藥或者少數民族醫(yī)藥中均有所應用[1],具有抗腫瘤[8]、降血糖[9]、抗炎、抗氧化[10]等多種藥理活性。
砂藍刺頭Turcz.為民間常用藥材,在遼寧、吉林、內蒙古、寧夏、陜西、甘肅、青海、新疆等省區(qū)沙漠地區(qū)均有分布[11]。其藥用部位包括干燥根、頭狀花序以及全草。根為常用中藥,具有清熱解毒、通乳、排膿的功效[12],多入湯劑[13]。在蒙醫(yī)中,全草具有止血、安胎、舒筋通脈的功效[14];頭狀花序有固骨質、接骨愈傷、清熱止痛之效,可治療骨折、骨熱、刺痛以及瘡瘍等疾病[13]。相關研究主要集中在砂藍刺頭植物的化學成分提取分離[15-17]以及生態(tài)資源[18-19]等方面。未見關于砂藍刺頭花的有效成分和質量評價的研究報道。本課題組前期從砂藍刺頭花(簡稱EGT)中分離得到了1-甲基-4-甲氧基-8-(β--葡萄吡喃型糖苷)-2(1)-喹啉酮(1-methyl-4-methoxy-8-(β-- glucopyranoside)-2(1)-quinolinone,以下簡稱MMQ)。以其為指標,建立EGT的薄層鑒別和含量測定方法,并結合指紋圖譜進行多成分定性評價,從而達到對EGT的定性和定量控制的目的。
Linomat-Ⅵ型薄層色譜自動點樣器(瑞士CAMAG公司)、Reprostar 3型薄層色譜攝像儀(瑞士CAMAG公司)、Mettler AE200型電子分析天平、KQ-250DB數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、Waters e2695 HPLC色譜儀、SX2-4-10型系列箱式電阻爐(上海陽光實驗儀器)。
EGT樣品S1(批號20180823)、S2(批號20180830)、S6(批號20180901)、S7(20180905),均采集于內蒙古通遼;S3(批號20180811)采集于內蒙錫林郭勒;S4(批號20180811)采集于內蒙錫林浩特;S5(批號20180905)采集于內蒙科左中旗;S8(批號20120814)和S9(批號20120815),采集于甘肅張掖;大藍刺頭花樣品S10(批號20110730),采集于新疆阿勒泰;硬葉藍刺頭花樣品S11(批號20120801),采集于新疆阿勒泰,S12(批號20110725)和S13(批號20120728)采集于新疆烏魯木齊;全緣藍刺頭花樣品S14(批號20120801)和S15(批號20110731)采集于新疆阿勒泰;藍刺頭花樣品S16(批號20101110)采集于內蒙古。以上藥材經上海中藥標準化研究中心吳立宏研究員分別鑒定為砂藍刺頭Turcz.、大藍刺頭Golosk.、硬葉藍刺頭L.、全緣藍刺頭Kir.和藍刺頭Tausch.的干燥頭狀花序。MMQ對照品由實驗室自制,HPLC面積歸一化法,質量分數大于98%。乙腈(色譜純,美國Fisher公司),水為超純水,其余試劑均為分析純。
取EGT藥材1.2 kg,95%乙醇回流提取3次、60%乙醇回流提取1次,提取1~2 h,回收乙醇。將濃縮液依次用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇萃取,合并并回收各有機溶劑。取正丁醇部位過MCI小孔樹脂,依次用不同濃度甲醇水體系洗脫,取30%甲醇段減壓濃縮后得浸膏5 g,通過硅膠和MCI等手段,分離得到目標化合物。經1H-NMR、13C-NMR鑒定,確定該成分為生物堿類化合物MMQ,經HPLC面積歸一法測定其質量分數大于98%。
2.2.1 供試品溶液的制備 取EGT粉末(過3號篩)0.25 g,加70%甲醇25 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加70%甲醇2 mL使溶解,作為供試品溶液。
2.2.2 對照品溶液的制備 取MMQ適量,加甲醇制成質量濃度為1 mg/mL的溶液,作為對照品溶液。
2.2.3 薄層色譜分別吸取供試品溶液和對照品溶液各5 μL,分別點于同一硅膠HSGF254薄層板上,以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶1∶1∶0.8)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品在與對照品相應的位置上,顯相同顏色的斑點。采用上述色譜方法對7批不同產地的EGT藥材(S1~S7)進行薄層色譜鑒別(S8、S9因采集時間較久,未采用),結果樣品中MMQ分離度較良好,斑點清晰,比移值(f)合適,并且7批藥材具有良好的一致性,見圖1。
2.3.1 供試品溶液的制備 取EGT樣品(S5,過3號篩)0.25 g,精密稱定,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱定質量,超聲(功率250 W,頻率40 kHz)處理30 min,放冷,用70%甲醇補充減失質量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。
S-MMQ S1~7-EGT樣品
2.3.2 色譜條件 以Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)為色譜柱;乙腈(A)-0.1%甲酸(B)為流動相梯度洗脫(0~7 min,5% A;7~35 min,5%~28% A;35~53 min,28%~90% A;53~65 min,90% A);體積流量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長為275 nm;進樣量為10 μL。
2.3.3 精密度試驗 稱取樣品粉末0.25 g(S5),按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液,按“2.3.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,以MMQ(S)峰為參照峰,計算色譜圖中特征峰相對保留時間和相對峰面積,結果顯示RSD分別為0.05%~0.49%和0.39%~2.15%。
2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同批次砂藍刺頭粉末(S5)1份,按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液,按“2.3.2”項下色譜條件分別于0、1、2、4、6、12、24 h進樣,以MMQ峰為參照峰,記錄和計算各共有峰相對保留時間、相對峰面積。結果顯示RSD分別為0.06%~0.54%和0.33%~1.89%。
2.3.5 重復性試驗 取同一批次砂藍刺頭粉末(S5)6份,按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液,按“2.3.2”項下色譜條件進樣,以MMQ為參照峰,記錄和計算各共有峰保留時間、相對峰面積,計算其RSD分別為0.07%~1.11%和0.32%~3.19%。
2.3.6 指紋圖譜的建立與分析 按“2.3.1”項和“2.3.2”項對樣品進行制備和測定,記錄色譜圖。運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)研究版(2004版)”,導入S1~S9號樣品HPLC數據,以S1為參照圖譜,選擇平均數法進行自動峰匹配,生成EGT對照指紋圖譜(圖2-A)。以EGT對照指紋圖譜為參照圖譜,同時導入7批(S10~S16)藍刺頭屬其他種樣品HPLC圖譜數據,選擇平均數法進行自動峰匹配,得到藍刺頭屬其他種圖譜(圖2-B)并計算相似度。計算得到S1~S9號樣品相似度分別為0.970、0.950、0.922、0.989、0.959、0.978、0.980、0.916、0.697,偽品相似度分別為0.849、0.452、0.806、0.327、0.499、0.580、0.832。除批號為20120815樣品外,其余EGT樣品相似度均在0.9以上,種內相似度較高,而藍刺頭屬其他種植物樣品相似度均低于0.9。將S1~S9號樣品與藍刺頭屬其他種樣品的指紋圖譜進行比較,并結合各色譜峰的峰形、峰高以及分離情況等信息,標定了8個特征峰,并經對照品指認4個峰,分別為2號峰是水楊酸、4號峰是綠原酸、5號峰是MMQ、6號峰是異綠原酸,其中MMQ是本研究發(fā)現的含量較高的專屬性成分,其色譜峰的對稱性好、峰較高,與相鄰色譜峰達到基線分離,故選定MMQ為參照峰(S)。并計算得到各特征峰相對保留時間的RSD均小于3%,表明特征峰的出峰時間較為穩(wěn)定,但其相對峰面積的RSD相差較大,表明不同批次中各成分含量存在一定的差異。將16批樣品指紋數據進行初步數據篩選,篩選出峰面積比>2%的指紋數據,結果導入SIMCA 13.0軟件,進行最小二乘法判別分析(orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA)與聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA),結果見圖3和圖4。從OPLS-DA和HCA結果顯示,EGT與藍刺頭屬其他種樣品分成2大類,說明所建立的EGT特征指紋圖譜有一定的鑒別作用,可用于EGT的質量評價。VIP結果顯示13號峰(MMQ)為最主要的貢獻成分,該成分為EGT的專屬性成分,可作為EGT含量測定的指標成分。
2-水楊酸 4-綠原酸 5-MMQ 6-異綠原酸
圖3 藍刺頭屬OPLS-DA圖(A) 及VIP (VIP>1.0,B) 圖
圖4 藍刺頭屬聚類分析
2.4.1 色譜條件 采用Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;乙腈-0.1%甲酸水溶液(14∶86)為流動相,體積流量為1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長為230 nm,進樣量為10 μL。理論板數按MMQ峰計不低于2500。對照品溶液和供試品溶液的HPLC見圖5。
圖5 MMQ對照品(A) 和砂藍刺頭花藥材(B) HPLC圖
2.4.2 供試品溶液的制備 取EGT樣品(過3號篩)0.25 g,精密稱定,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱定質量,超聲(功率250 W、頻率40 kHz)處理30 min,放冷,用70%甲醇補充減失質量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。
2.4.3 對照品溶液的制備 精密稱取MMQ對照品10.12 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成含1.012 mg/mL MMQ的溶液,作為對照品貯備溶液。
2.4.4 線性關系考察 用70%甲醇對貯備液進行逐級稀釋,得到2.024、20.240、50.600、101.200、151.800 μg/mL的系列對照品溶液,分別精密吸取溶液各10 μL,注入色譜儀進行測定,以對照品的進樣質量濃度為橫坐標(),峰面積為縱坐標(),進行線性回歸,得標準曲線方程為=35.919-4.386 4,=1.000 0,結果表明,MMQ在2.024~151.800 μg/mL線性關系良好。
2.4.5 定量限和檢測限 取對照品貯備溶液,逐步稀釋,按“2.4.1”項下色譜條件進樣,進樣量為10 μL,信噪比()為10∶1,測得MMQ的定量限約為2.024 μg/mL。信噪比()為3∶1時,MMQ的檢測限約為0.607 μg/mL。
2.4.6 精密度試驗 選取高、中、低(101.200、50.600、20.240 μg/mL)3個質量濃度的對照品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件下同1 d內連續(xù)進樣6次,測得MMQ峰面積的RSD分別為0.73%、0.95%、1.37%。連續(xù)測定3 d,每天進樣1次,記錄MMQ峰面積,測得MMQ峰面積的RSD分別為2.06%、1.61%、1.88%。結果顯示日內、日間精密度均小于3%。表明日內、日間精密度良好,儀器穩(wěn)定。
2.4.7 重復性試驗 取樣品粉末0.25 g(S5),按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,平行6份,按“2.4.1”項下色譜條件進樣,進樣量為10 μL,記錄MMQ的峰面積。采用外標一點法計算MMQ的含量,樣品中MMQ的質量分數為5.28 mg/g,RSD為1.37%,表明此方法重復性好。
2.4.8 穩(wěn)定性試驗 取樣品粉末0.25 g(S5),按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件分別于0、1、2、4、8、12、24 h進樣,進樣量為10 μL,結果顯示MMQ峰面積的RSD為1.81%,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。
2.4.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的EGT粉末0.125 g(S5)精密稱定,按已測定的50%、100%、150%精密加入對照品溶液,按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件進樣,記錄峰面積,采用外標一點法計算加樣回收率。結果MMQ的平均加樣回收率為101.5%,RSD為1.46%。
2.4.10 定量測定 取7批EGT樣品,按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件進樣,經HPLC測定后,結果顯示7批EGT(S8、S9因采集時間較久,未測定)的質量分數范圍在0.13%~0.53%,見表1。
EGT為蒙古族習用藥材,目前無相關的質控標準以及專屬性成分的研究,本研究通過MCI色譜、硅膠色譜、高效液相色譜等分離手段,得到專屬性成分,經核磁鑒定為一種喹啉酮類生物堿(MMQ)。本實驗將EGT與其它4種近源樣品:大藍刺頭、硬葉藍刺頭、全緣藍刺頭和藍刺頭,進行薄層色譜和HPLC檢測比較,結果顯示大藍刺頭、硬葉藍刺頭、全緣藍刺頭不含有MMQ,在藍刺頭樣品中雖含有少量MMQ,但遠低于其檢測線。因此MMQ作為砂藍刺頭中含量較高且專屬性較強的成分,建立以其為指標成分定性定量方法,有一定的科學性與實用性,可以更好地評價EGT藥材的質量。
表1 7批EGT藥材中MMQ含量測定結果(n=3)
在薄層鑒別展開劑的考察中,發(fā)現酸對于薄層展開體系的影響較大,非酸體系下,斑點較少、分離度較差。篩選了多種顯色劑,包括磷鉬酸、碘化鉍鉀、碘、10%硫酸乙醇等,顯色效果均不佳,不顯色或者顯色不靈敏,最終定為以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶1∶1∶0.8)為展開劑,254 nm紫外燈下檢視熒光斑點即可。比較了不同廠家的薄層板:銀龍-HSGF254板、黃海-HSGF254板、德國MNSGF板和德國MNHSGF板,所建立的薄層方法在上述幾種板中均能獲得很好的展開效果,其中以德國MNHSGF板分離效果最好。
中藥色譜指紋圖譜能夠較為全面地反映中藥的整體質量。本實驗建立指紋圖譜分析方法能很好地將EGT與同屬其他植物相區(qū)別。相似度分析評價中,S9(批號20120815)相似度僅為0.679,其他EGT樣品相似度均高于0.9,這提示EGT樣品陳置過久可能會影響其藥材質量。這一發(fā)現為藥材市場中EGT藥材年限控制提供數據參考。不同來源的9批樣品指紋圖譜中的共有峰在數目以及相對保留時間上保持一致,但各共有峰相對峰面積有一定的差異,說明各批次藥材之間的質量存在差異,推測可能與藥材產地、生長年限、采收期等因素有關。將EGT和其他種藍刺頭的指紋數據進行統(tǒng)計分析,主成分分析和聚類分析結果一致,均能實現EGT與同屬其他植物(藍刺頭、全緣葉藍刺、硬葉藍刺頭和大藍刺頭)的區(qū)別。在PCA中,16批樣品聚為2大類,S1~S9號樣品為不同批次EGT,S10~16號樣品為藍刺頭屬其他種樣品,其中S8和S9號樣品為2012年收集的樣品,雖經放置多年,成分有所下降,但仍歸為EGT中。在聚類分析中,S8和S9號樣品處于同一組中;S14和S15號樣品為全緣藍刺頭也在同一組中,該結果與OPLS-DA結果一致。
在建立MMQ的定量分析方法實驗中,進行了提取方法(超聲、加熱回流)、提取溶劑(純甲醇、70%甲醇、50%甲醇)、提取時間和提取次數的考察。最終確定的提取方便操作簡單、省時,對砂藍刺頭中MMQ提取率高??疾炝艘译?水、乙腈-醋酸銨緩沖鹽水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液等流動相體系對液相色譜分離效果的影響。最終確定的含測方法重復性好,MMQ的分離度和含量測定RSD均符合檢測要求。另外,由于S8和S9藥材采集時間過久,為了不影響含量限度制定的準確性,未對這2批藥材進行含量測定。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
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Study on qualitative and quantitative control method for
CAO Lan-lan1, CHENG Xue-mei1, YANG Li-guo2, WANG Xiu-lan2, AO Wu-liji2, WANG Chang-hong1
1. Institute of traditional Chinese Medicine, Shanghai University of traditional Chinese Medicine, key Laboratory of Chinese Medicine Standardization Ministry of Education, Shanghai compound Chinese Medicine key Laboratory, Shanghai Research Center for Standardization of traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. School of Mongol Medicine, Inner Mongolia University for Nationalities, National and Local Joint Engineering Research Center for Mongolian Medicine Research and Development, Tongliao 028000, China
To establish the quality control method for of.Thin layer chromatography (TLC) method was used for quanlitative analysis of the 1-methyl-4-methoxy-8-(β--glucopyranoside)-2 (1H)-quinolinone (MMQ) with a mixture of trichloromethane-ethyl acetate-methanol-formic acid (6∶1∶1∶0.8) as the developing solvent. The HPLC fingerprint of the capitulum ofand the determination of MMQ were conducted by HPLC.The spots on TLC plate were clear, well-separated and specific without any interference. The linear range of calibration curve was 2.024—151.800 μg/mL, and the average recovery was 101.5% with RSD of 1.46%, which can be used for the quality control of. The contents of MMQ in seven batches ofwere 0.13%—0.53%.The qualitative and quantitative determination method is scientific and reliable, which can provide an experimental basis for the establishment of the quality standard of.
Turcz.; quality control; TLC; HPLC; 1-methyl-4-methoxy-8-(β--glucopyranoside)-2(1)-quinolinone.
R286.6
A
0253 - 2670(2021)06 - 1759 - 06
10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.026
2020-08-06
蒙藥研發(fā)國家地方聯合工程研究中心開放基金項目(MDK2019043);內蒙古自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局內蒙古蒙藥材標準研究課題采購項目(JYCZ18-026);中央引導地方科技發(fā)展專項資金計劃項目:蒙醫(yī)藥現代化關鍵技術研究及蒙藥產業(yè)化
曹嵐嵐,碩士研究生,研究方向為中藥新制劑與體內過程研究。Tel: (021)51322511 E-mail: c18516607305@126.com
王長虹,博士,研究員,研究方向為中藥新制劑與體內過程研究。Tel: (021)51322511 E-mail: wchcxm@163.com
[責任編輯 時圣明]