馮茜茜 ， 陳 革 ， 張清一 ， 王鵬勇 ， 楊躍飛 ， 王彥紅

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009 ； 2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009)

大腸桿菌(Escherichiacoil,E.coli)是人和動(dòng)物腸道內(nèi)常見菌之一，正常情況下為非致病性共生菌，在特殊條件下會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌病的發(fā)生[1]。致病性大腸桿菌會(huì)引起仔豬黃痢、白痢、豬水腫和敗血癥等疾病。有些豬源致病性大腸桿菌具有一些黏附素相關(guān)毒力基因(如fimH和pap)，能增加尿路感染的機(jī)會(huì)，稱為尿路致病性大腸桿菌(UropathogenicEscherichiacoil，UPEC)，這些菌株可能引起人致病，是潛在的人獸共患病病原。能夠促使UPEC入侵尿道細(xì)胞的重要毒力因子是黏附素，主要包括I型菌毛、P型菌毛、S型菌毛和FIC型菌毛。Ⅰ型菌毛由1個(gè)操縱子編碼，包括fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG和fimH共9個(gè)基因；P型菌毛由pap操縱子編碼，存在papA、papC、papGalleleⅠ、papGalleleⅢ等基因；FIC型菌毛由focA和focG等基因編碼；S型菌毛基因由sfaS等基因編碼。UPEC表達(dá)黏附素(如I型和P型菌毛)使細(xì)菌易于結(jié)合并侵入尿道內(nèi)的宿主細(xì)胞和組織[3]。

大腸桿菌感染是豬生產(chǎn)中重要疾病之一，能引起重大的經(jīng)濟(jì)損失，隨著我國養(yǎng)豬規(guī)?；I(yè)化的發(fā)展，豬場大腸桿菌的暴發(fā)呈上升趨勢。人和豬分離的大腸桿菌菌株之間的相似性表明，大腸桿菌存在不同宿主之間交叉感染的可能性[4]。因此，本試驗(yàn)選擇8種黏附素相關(guān)基因進(jìn)行檢測，以期探討本地區(qū)豬源大腸桿菌黏附素部分毒力基因的攜帶情況，同時(shí)進(jìn)行耐藥性分析，為豬大腸桿菌病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 以本課題組2017年7—12月從揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院就診的病死豬脾、肝等組織作為病料。

1.2 主要試劑與儀器 瓊脂粉、氯化鈉，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麥康凱瓊脂粉，購自杭州微生物試劑有限公司；生化鑒定管和藥敏試紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司；PCR試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司。

超凈工作臺(tái)(型號(hào)為SW-CJ-IL)，購自蘇州凈化工作臺(tái)設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)為GNP9080)，購自上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；DNA擴(kuò)增儀(型號(hào)為4484073)，購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；凝膠電泳儀(型號(hào)為DYCP-31DN)，購自北京六一生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌分離鑒定 將采集的樣品無菌操作接種于麥康凱平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取典型的單菌落再純化分離。挑取麥康凱瓊脂上粉紅色單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)及生物學(xué)特性。將純化的細(xì)菌進(jìn)一步進(jìn)行生化鑒定。

1.4 藥敏試驗(yàn) 通過Kirby-Bauer(K-B)紙片瓊脂擴(kuò)散法測定15種抗菌藥物的耐藥性，無菌操作將25株分離菌的純培養(yǎng)物均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Insitute,CLSI)(2009年)標(biāo)準(zhǔn)判定其耐藥性。

1.5 提取DNA 采用煮沸裂解法提取細(xì)菌的DNA。大腸桿菌分離株在血平板上純培養(yǎng)，挑取適量細(xì)菌，混入2 mL離心管中，充分混合均勻。離心管放入沸水中煮沸10 min，取出。冷卻至室溫后，放入-20 ℃保存，備用。

1.6 大腸桿菌黏附素相關(guān)基因檢測 利用PCR技術(shù)對黏附素相關(guān)基因進(jìn)行檢測，待檢測基因有Ⅰ型菌毛相關(guān)基因fimH，P型菌毛相關(guān)基因papA、papC、papGalleleⅠ、papGalleleⅢ，F(xiàn)IC型菌毛基因focA、focG，S型菌毛基因sfaS。相關(guān)基因引物根據(jù)參考文獻(xiàn)[5-8]合成(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 大腸桿菌黏附素相關(guān)基因PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR amplification primer targeting Escherichia coli adhesion-related genes

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定 2017年7—12月，采集25份病死豬樣品，其中7份脾臟、12份肝臟和5份心臟以及1份肺臟組織作為病料。經(jīng)細(xì)菌分離，在麥康凱培養(yǎng)基上形成中等大小、表面光滑、邊緣整齊的紅色菌落。生化鑒定結(jié)果顯示，25株分離得到的菌株均能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖，少數(shù)能發(fā)酵蔗糖，并且都不能夠使甘露糖發(fā)酵；吲哚試驗(yàn)為陽性，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)均為陰性，均符合大腸桿菌的生化特性。

2.2 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果見表2，25株豬源大腸桿菌對多西環(huán)素、卡那霉素、復(fù)方新諾明、氟苯尼考等10種藥物有較強(qiáng)的耐藥性，對丁胺卡那敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity testing results

2.3 大腸桿菌黏附素相關(guān)基因檢測 PCR擴(kuò)增后，通過瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，將目的片段送至南京金瑞斯生物公司測序，測序結(jié)果上傳GenBank進(jìn)行序列比對，基因確認(rèn)后的菌株作為陽性對照。25株菌黏附素相關(guān)基因檢測結(jié)果顯示，部分菌株檢測出fimH、papC和focG基因，檢測率分別為40%、8%和4%，papA、papGalleleⅠ、papGalleleⅢ、focA、sfaS基因均未被檢測出。部分基因的電泳結(jié)果見圖1～3。同時(shí)攜帶fimH和papC基因的僅有1株。

圖1 fimH基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of fimH geneM：100 bp DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～8：樣品； 9：陽性對照； 10：陰性對照M:100 bp DNA marker; 1-8:Samples; 9:Positive control; 10:Negative control

3 討論

本試驗(yàn)共分離出25株豬源大腸桿菌，對15種臨床常用藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，從臨床病例分離的大腸桿菌耐藥比較嚴(yán)重，多西環(huán)素耐藥率最高，多西環(huán)素抗菌譜廣，養(yǎng)殖過程中大量使用此類藥物用于預(yù)防和治療疾病，是導(dǎo)致耐藥的一種原因，另一種原因可能是耐藥基因的水平傳播。除多西環(huán)素外，25株菌對喹諾酮類、磺胺類、氯霉素類抗菌藥耐藥，對美洛西林、環(huán)丙沙星、鏈霉素的耐藥率也超過50%，此耐藥情況與國內(nèi)其他大腸桿菌耐藥情況類似[9]。

圖2 focG基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of focG geneM：100 bp DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：陰性對照； 2：陽性對照； 3～19：樣品M:100 bp DNA marker; 1:Negative control; 2:Positive control; 3-19:Samples

圖3 papC基因的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of papC geneM：100 bp DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～13：樣品； 14：陽性對照； 15：陰性對照M:100 bp DNA marker; 1-13:Samples; 14:Positive control; 15:Negative control

25株菌檢測8種黏附素相關(guān)基因結(jié)果顯示，菌株攜帶fimH、papC和focG基因，攜帶率分別為40%、8%和4%，此外，僅1株細(xì)菌同時(shí)攜帶fimH和papC。UPEC致病的第1步是定植到宿主細(xì)胞上，黏附素的表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)菌的毒力。較多的腸外致病性大腸桿菌攜帶有Ⅰ型菌毛基因fimH，Ⅰ型菌毛是腸外大腸桿菌進(jìn)行黏附的重要毒力基因，fimH蛋白能夠暴露于細(xì)菌表面，介導(dǎo)與D-甘露糖受體的特異性結(jié)合[10]?？少x予Ⅰ型菌毛結(jié)合D-甘露糖，并結(jié)合許多類型的真核細(xì)胞(包括腸、肺、膀胱、腎上皮和各種炎癥細(xì)胞)的能力對保護(hù)大腸桿菌免受吞噬有直接或間接的作用[11]。P型菌毛主要由pap(Pyelonephritis-associated pili)基因簇表達(dá)蛋白共同組裝構(gòu)成，介導(dǎo)尿道致病性大腸桿菌的黏附定植，與動(dòng)物的泌尿道感染有著密切關(guān)系。在UPEC的流行病學(xué)中發(fā)現(xiàn)，70%的腎盂腎炎病例表達(dá)P菌毛，膀胱炎病例和無癥狀尿道感染分離的UPEC分別有36%、24%菌株攜帶該菌毛。FIC菌毛foc和S菌毛sfa這2種黏附素具有高度同源性，F(xiàn)IC型菌毛主要黏附遠(yuǎn)端小管和集合管上皮細(xì)胞。Zhu等[12]對豬源大腸桿菌毒力基因研究發(fā)現(xiàn)fimH、papC、papA、sfaS基因的檢測率分別為81.3%、21.9%、4.7%和1.6%。Tan等[13]的研究顯示，fimH基因在豬分離株中檢出率高達(dá)85.4%。Khan等[14]的研究中fimH、sfaS、focG基因的檢出率均在50%以上，papA、papC基因的檢出率均在40%以上。通過上述研究可知，較多豬源大腸桿菌與UPEC具有相似的黏附素相關(guān)基因，是一種潛在的人獸共患病病原，加強(qiáng)豬大腸桿菌感染的防控具有一定的公共衛(wèi)生安全意義。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，從動(dòng)物醫(yī)院臨床病料中分離得到的豬源大腸桿菌對喹諾酮類和磺胺類藥物的耐藥性比較嚴(yán)重，盡管分離到的腸外致病性大腸桿菌攜帶有Ⅰ型菌毛基因(fimH)、P型菌毛基因(papC)以及FIC菌毛基因(focG)，與尿路致病有著密切關(guān)系，但菌株的毒力與基因型之間的關(guān)系以及尿道致病機(jī)制無法確定，還需進(jìn)一步研究。