張文娟，姚 瑤，強 瓊，楊 樂，劉琳娜（中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710038）

伏立康唑是新一代三唑類抗真菌藥物，其抗菌譜廣，抗菌作用強，越來越多的用于曲霉菌、新型隱球菌、念珠菌等真菌感染的治療，被各大指南推薦作為侵襲性曲霉菌病的首選藥物。伏立康唑的療效、不良反應(yīng)與血藥濃度相關(guān)，研究[1-3]表明，食物、年齡均可影響其血藥濃度，且伏立康唑治療窗較窄，藥物暴露量與CYP2C19的基因多態(tài)性具有顯著相關(guān)性，又與多種藥物之間存在相互作用，這些都可影響其療效和安全性。伏立康唑具有非線性動力學(xué)特征，同一劑量下患者的血藥濃度會有不同，因此對其實施血藥濃度監(jiān)測具有重要意義。近年來，多個指南均推薦對伏立康唑進行血藥濃度監(jiān)測，以達到臨床安全有效的目的，基于此，我們建立了運用反相高效液相色譜法測定血清中伏立康唑藥物濃度，對我院2017年7月 -2019年11月血液科460例住院患者的611個標(biāo)本進行了伏立康唑血藥濃度的監(jiān)測和分析，旨為臨床安全合理用藥提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LC-2030液相色譜儀（日本島津儀器公司），Inertsil ODS-3色譜柱（日本 GL Sciences公司），MX-S旋渦混合器[大龍興創(chuàng)實驗室儀器（北京）有限公司]，MiniSpin離心機（德國Eppendorf公司），KH5200PV型超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），電子分析天平（十萬分之一）（德國Sartorius公司），Milli-Q Advantage A10超純水機（德國默克密理博公司）。

1.2 試劑

伏立康唑?qū)φ掌罚ㄖ袊幤飞镏破窓z定所，批號：100862-201402）；酮康唑?qū)φ掌罚ㄖ袊幤飞镏破窓z定所，批號：100294-201203）；甲醇和乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；冰醋酸為分析純（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；三乙胺為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。空白血清由唐都醫(yī)院輸血科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈 : 冰醋酸-三乙胺緩沖液 = 45∶55（v/v），流速1.0 mL·min-1；進樣量20 μL；室溫25 ℃；紫外檢測波長255 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配置

2.2.1 伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱定伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品77.59 mg，以甲醇定容至50 mL容量瓶中，儲備液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱定酮康唑?qū)φ掌?07.61 mg，以甲醇定容至50 mL容量瓶中，儲備液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血清樣品處理方法

取血清450 μL，加入不同濃度的伏立康唑工作液30 μL和內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，漩渦30 s混勻，加入乙腈溶液500 μL，漩渦3 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進樣。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 專屬性考察患者血清按照“2.3”項下方法進行預(yù)處理，進樣得色譜圖。伏立康唑和血清雜質(zhì)及內(nèi)標(biāo)之間分離良好。詳見圖1。

圖1 HPLC色譜圖A-空白血清，B-空白血清 + 伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品 + 內(nèi)標(biāo)，C-患者血清；1-伏立康唑，2-酮康唑（內(nèi)標(biāo)）Fig 1 HPLC chromatogramA-blank serum, B-blank serum + voriconazole standard + internal standard, C-serum of patients; 1-voriconazole, 2-ketoconazole(internal standard)

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系考察取空白血清450 μL，共7份，分別加入不同濃度的伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，使伏立康唑的藥物濃度分別為0.097、0.58、1.46、2.93、5.85、11.69、23.38 μg·mL-1，按“2.3”項下方法處理。按照“2.1”項下方法測定。測定結(jié)果以伏立康唑濃度（X）為橫坐標(biāo)，伏立康唑與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，用最小二乘法作線性回歸，得到血清中伏立康唑濃度回歸方程：Y= 0.029 5X-0.003 8，r= 0.999 0。血清中伏立康唑在0.097～23.380 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.3 回收率試驗取濃度分別為0.58、5.85、23.38 μg·mL-1伏立康唑工作液各5個樣品。按“2.3”項下方法處理后進樣分析。取含量相同的伏立康唑工作液直接進樣分析，計算伏立康唑在血清中的提取回收率，用回歸方程計算方法回收率，詳見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery test

2.4.4 精密度試驗配制上述回收率考察試驗中的3個濃度伏立康唑血清樣品，分別在同日內(nèi)不同時間點和不同日處理后進樣分析，計算日內(nèi)精密度和日間精密度，低、中、高三個濃度的日內(nèi)和日間精密度分別為0.89%～4.47%和0.72%～4.22%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗1）血清樣本室溫放置穩(wěn)定性：配制伏立康唑濃度分別為0.58、5.85、23.38 μg·mL-1血清樣品，于室溫下放置，分別在配制后的2、4、6、8 h處理后進樣分析。伏立康唑低、中、高三種濃度血清樣本，室溫放置穩(wěn)定性的RSD為0.96%～1.22%。2）血清樣本凍融穩(wěn)定性：配制伏立康唑濃度分別為0.58、5.85、23.38 μg·mL-1血清樣品，于-20 ℃冰箱冰凍保存，分別在第0、3、7、14 d解凍測定，考察伏立康唑低、中、高3種濃度血清樣品，凍融穩(wěn)定性的RSD為1.16%～8.42%。

2.4.6 重復(fù)性考察取低、中、高三個濃度血清樣品，按“2.3”項下方法平行處理后分別連續(xù)進樣分析5次。結(jié)果顯示伏立康唑和酮康唑峰面積比值的RSD為0.12%～8.37%。

2.5 血液腫瘤患者伏立康唑血藥濃度測定結(jié)果

應(yīng)用上述方法對2017年7月- 2019年11月在我院血液科住院的460例患者的611個標(biāo)本進行了伏立康唑血藥濃度測定。460例患者中男性比例為55.65%，女性比例為44.35%，臨床診斷包括急慢性淋巴細(xì)胞白血病、急慢性粒細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤以及再生障礙性貧血。給藥方式包括口服（164例次）和靜脈滴注（447例次），所有用藥均用于預(yù)防或治療肺部真菌感染，藥物未區(qū)分生產(chǎn)廠家。相關(guān)指南[4]指出，監(jiān)測穩(wěn)態(tài)谷濃度具有良好的臨床意義，伏立康唑給予負(fù)荷劑量時第3天達穩(wěn)態(tài)血藥濃度，未給予負(fù)荷劑量的則在第5～7天達穩(wěn)態(tài)血藥濃度。本實驗所有標(biāo)本均嚴(yán)格按照要求，在血藥濃度達穩(wěn)態(tài)后的第一次給藥前30 min內(nèi)采集，本監(jiān)測結(jié)果表明血藥濃度能夠達到指南推薦的1.0～5.5 μg·mL-1的患者比例為67.10%（表2）；男性血藥濃度與女性相比相差不大（表3，P＞ 0.05）；大于60歲老年患者血藥濃度總體水平較高（表4），這可能與老年人代謝緩慢有關(guān)；口服給藥和靜脈給藥血藥濃度有顯著性差異，靜脈給藥血藥濃度總體水平較高（表5，P＜ 0.01）。

表2 血藥濃度分布情況Tab 2 Distribution of serum drug concentration

表3 不同性別患者血藥濃度情況Tab 3 Serum drug concentration in different gender

表4 不同年齡組血藥濃度情況Tab 4 Serum drug concerntration in different age groups

表5 不同給藥方式血藥濃度情況Tab 5 Serum drug concerntration of different ways of administration

3 討論

目前，國內(nèi)外進行伏立康唑血藥濃度監(jiān)測的方法有超高液相、串聯(lián)質(zhì)譜、固相萃取-HPLC法、酶免疫放大法等[5-9]，超高液相以及串聯(lián)質(zhì)譜的速度、靈敏度和分離度都較高，非常適合復(fù)雜組分及微量元素的測定，但這兩種儀器的固定資產(chǎn)投入較大，不利于臨床推廣；固相萃取技術(shù)作為樣品前處理方法，已普遍應(yīng)用于實驗中，能有效的將標(biāo)的物質(zhì)與雜質(zhì)分離，但該法相對于蛋白沉淀法耗時過長。以服務(wù)臨床為目的，不僅要做到高效、準(zhǔn)確，還要做到快速和便于推廣，故本研究選擇了高效液相色譜法。

在方法學(xué)建立過程中，筆者比較了應(yīng)用甲醇沉淀蛋白、乙腈沉淀蛋白的提取方法，乙腈沉淀蛋白處理的組織樣品無雜質(zhì)，藥物提取回收率高。此外還考察了血清與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對伏立康唑濃度監(jiān)測的影響，發(fā)現(xiàn)血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)對伏立康唑有明顯干擾，導(dǎo)致二者分離度差，所以采用血清樣本進行測定。

伏立康唑的分子結(jié)構(gòu)中含有三唑環(huán)、吡啶環(huán)等堿性基團，在流動相中加入一定比例的三乙胺，不僅可以調(diào)節(jié)流動相的pH值，還可作為掃尾劑，防止色譜峰的拖尾，改善峰形[10]。

本研究所測定的患者血樣為血液腫瘤患者樣本，此類患者用藥最突出的特點就是合并用藥多，采用本研究建立的方法分離度好，能夠很好的排除合并用藥的干擾，使得目標(biāo)藥物與內(nèi)標(biāo)的分離度良好。因此本研究建立的方法具有實用性強、操作簡便、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好的特點，可作為伏立康唑血藥濃度日常監(jiān)測方法，為臨床合理安全用藥提供有力的保障。目前國內(nèi)外研究結(jié)果表明，伏立康唑藥動學(xué)個體差異大，且臨床療效和不良反應(yīng)與血藥濃度顯著相關(guān)[11-17]，故指南建議，在給藥4～7 d后應(yīng)監(jiān)測伏立康唑血藥谷濃度，以指導(dǎo)劑量調(diào)整，使谷濃度水平達到有效治療范圍[17]，根據(jù)國外指南推薦伏立康唑可能的安全濃度范圍為1.0～5.5 μg·mL-1，研究表明，當(dāng)谷濃度高于1 μg·mL-1時，療效增加，當(dāng)谷濃度≥4 μg·mL-1，神經(jīng)毒性增加，谷濃度≥ 5 μg·mL-1，肝毒性增加，因此谷濃度范圍在1.0～5.5 μg·mL-1可以實現(xiàn)療效最大化、不良反應(yīng)最小化，本研究測定的標(biāo)本67.10%谷濃度達到該范圍，對于未達標(biāo)的原因還應(yīng)做更進一步的探索。血液腫瘤患者免疫功能低下，病原菌及感染灶不明確，臨床上通常采用經(jīng)驗性治療。經(jīng)驗用藥使患者獲益的同時也存在風(fēng)險，如抗感染效果欠佳，不良反應(yīng)發(fā)生率升高等。因此，建議臨床應(yīng)結(jié)合病原學(xué)檢查結(jié)果及時調(diào)整抗菌藥物的使用，并根據(jù)血藥濃度優(yōu)化給藥策略，實現(xiàn)精準(zhǔn)治療[18-20]。