常 婧， 程彥博

(1.遼寧省森林經(jīng)營(yíng)研究所，遼寧 丹東 118002；2.遼寧省林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110036)

篤斯越桔，又稱(chēng)越桔、藍(lán)漿果，為多年生落葉或常綠灌木[1]。我國(guó)篤斯越桔大多分布在東北三省以及內(nèi)蒙古地區(qū)[2]。近年來(lái)，因篤斯越桔果實(shí)含豐富氨基酸、礦質(zhì)元素以及花青甙，低糖、低脂肪，抗氧化能力強(qiáng)，鮮美可口，無(wú)污染，深受人們的青睞[3]。篤斯越桔屬于野生酸性植物，果實(shí)小不易采摘，且產(chǎn)量不穩(wěn)定，導(dǎo)致篤斯越桔資源的稀缺，在市場(chǎng)上出現(xiàn)了供不應(yīng)求的現(xiàn)象[4]。工廠化育苗是快速增加篤斯越桔資源的途徑之一。近年來(lái)，隨著微體快繁技術(shù)的迅速發(fā)展，篤斯越桔的組織培養(yǎng)有了一定的研究基礎(chǔ)，如外植體、培養(yǎng)基的篩選，激素種類(lèi)及質(zhì)量濃度的確定等，但是缺乏系統(tǒng)化的研究[5-9]。為此本論文建立了完善的篤斯越桔組織培養(yǎng)體系，可為篤斯越桔資源的保護(hù)與利用，工廠化繁殖提供一定的科技支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

通過(guò)對(duì)沈陽(yáng)市渾南區(qū)高坎街道皇冠藍(lán)莓寶石莊園的15個(gè)無(wú)性系篤斯越桔綜合評(píng)定，篩選出優(yōu)良無(wú)性系篤斯越桔，對(duì)此無(wú)性系的150株篤斯越桔品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，篩選出優(yōu)良單株2015-Z。

1.2 方 法

1.2.1 外植體選擇

選取篤斯越桔2015-Z優(yōu)良單株2～5節(jié)處成熟、健康且無(wú)病蟲(chóng)害葉片和帶芽莖段，進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。先將外植體清洗潔凈，用0.1%HgCl2浸泡4 min，用無(wú)菌水沖洗3次。在葉片的遠(yuǎn)軸面靠近中脈處橫切兩刀，然后將葉片遠(yuǎn)軸面向上接種。帶芽莖段剪成長(zhǎng)0.5～1.0 cm。

將滅菌后的兩種外植體均接種到改良的WPM+ZT 1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂粉6.5 g·L-1上培養(yǎng)，pH值調(diào)至6.0。各接種10瓶，3次重復(fù)，30 d后調(diào)查誘導(dǎo)結(jié)果。

1.2.2 滅菌方法篩選

將帶芽莖段剪成長(zhǎng)1.0～2.0 cm的小段，清水沖洗后，采用9種處理進(jìn)行滅菌(表1)。將滅菌后的帶芽莖段用無(wú)菌水沖洗3次，接種至改良WPM培養(yǎng)基上。每個(gè)處理10個(gè)莖段，3次重復(fù)，2周后觀察外植體存活以及感染情況。

表1 帶芽莖段的滅菌處理

初代培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基均添加蔗糖25 g·L-1、瓊脂粉6.5 g·L-1，pH值調(diào)至6.0。

1.2.3 篤斯越桔初代誘導(dǎo)

將1.0～1.5 cm的帶芽莖段接種于添加玉米素ZT(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1)的改良WPM培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶5個(gè)莖段，3次重復(fù)，接種后20 d觀測(cè)記錄芽苗誘導(dǎo)情況。

1.2.4 篤斯越桔增殖培養(yǎng)

腋芽伸長(zhǎng)至2 cm左右時(shí)，將試管苗轉(zhuǎn)接于添加不同激素的改良WPM培養(yǎng)基中。不同激素配比分別為：IBA 0.5 mg·L-1；ZT 0.5 mg·L-1； IBA 1.0 mg·L-1；ZT 1.0 mg·L-1；IBA 1.5 mg·L-1；ZT 1.5 mg·L-1；IBA 0.5 mg·L-1+ZT 0.5 mg·L-1； IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1；IBA 1.5 mg·L-1+ZT 1.5 mg·L-1；IBA 0.5 mg·L-1+ZT 0.5 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1；IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1+ KT 1.0 mg·L-1；IBA 1.5 mg·L-1+ ZT 1.5 mg·L-1+ KT 1.5 mg·L-1。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶5個(gè)帶芽莖段，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后記錄增殖結(jié)果。

1.2.5 光照強(qiáng)度對(duì)試管苗增殖影響

將初代培養(yǎng)的試管苗轉(zhuǎn)移到改良的WPM+IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基中，采用太陽(yáng)光+2 000 lx(處理Ⅰ)、2 000 lx(處理Ⅱ)、3 000 lx(處理Ⅲ)三種光照條件進(jìn)行組織培養(yǎng)。每個(gè)處理10瓶，每瓶轉(zhuǎn)5個(gè)單芽莖段，3次重復(fù)。30 d后調(diào)查苗高、增殖率、增殖系數(shù)等。

1.2.6 篤斯越桔生根培養(yǎng)

剪取2.0 cm左右的篤斯越桔試管苗，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上。以1/2WPM(改良)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加激素和培養(yǎng)方式見(jiàn)表2。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶5個(gè)單芽莖段，3次重復(fù)，50 d后調(diào)查生根情況。

表2 篤斯越桔生根培養(yǎng)正交試驗(yàn)水平和因素

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS軟件進(jìn)行方差分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

接種10 d后，莖段底部開(kāi)始有淡綠色的愈傷組織產(chǎn)生，接種20 d后，愈傷組織開(kāi)始形成，部分莖段出現(xiàn)不定芽。葉片誘導(dǎo)的愈傷組織為白色或淡黃色，生長(zhǎng)遲緩，其中一小部分愈傷組織能分化出不定芽，有些則褐化致死。接種30 d后，葉片褐化率較高，誘導(dǎo)率較低；莖段褐化率相對(duì)較低，誘導(dǎo)率較高(表3)。因此，選用帶芽莖段作為篤斯越桔組培的外植體。

表3 不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同滅菌方法比較

從表4可以看出，75%乙醇和2%次氯酸鈉混合處理的滅菌效果均不理想，污染率極高。而用75%乙醇浸泡20 s，再用0.1%HgCl2浸泡3 min，外植體污染率較低，出芽率最高。

表4 不同滅菌方法的滅菌效果

2.3 篤斯越桔初代培養(yǎng)基的篩選

接入初代培養(yǎng)基10 d，個(gè)別莖段已經(jīng)呈現(xiàn)出淺綠色愈傷組織。從表5可以看出，培養(yǎng)20 d后，添加ZT的培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)芽苗分化。其中，ZT質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，篤斯越桔試管苗分化系數(shù)和分化率最高，生長(zhǎng)速度較快，苗高且壯。所以，篤斯越桔最適初代培養(yǎng)基為WPM(改良)+ZT 1.0 mg·L-1。

表5 ZT對(duì)篤斯越桔試管苗誘導(dǎo)的影響

2.4 篤斯越桔增殖培養(yǎng)基的篩選

篤斯越桔試管苗經(jīng)過(guò)30 d增殖培養(yǎng)后，所有處理的篤斯越桔苗均有不同程度的增殖。從增殖率及增殖系數(shù)可以看出，ZT對(duì)篤斯越桔增殖影響最大，起到了決定性作用，其次是IBA。由表6可知，IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1的增殖率和增殖系數(shù)均最高，且苗木粗壯，生長(zhǎng)較旺盛，木質(zhì)化程度高。因此，篤斯越桔最佳增殖培養(yǎng)基為WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1。

表6 篤斯越桔試管苗增殖培養(yǎng)結(jié)果

2.5 不同光照強(qiáng)度對(duì)試管苗增殖的影響

從表7可以看出，不同光照強(qiáng)度的組培苗，在前2周培育時(shí)，各生長(zhǎng)性狀沒(méi)有顯著差異，但從第3周開(kāi)始，在不同光強(qiáng)的培養(yǎng)下，幼苗生長(zhǎng)逐漸呈現(xiàn)不同，培養(yǎng)第5周，處理Ⅰ繁育的苗木分化數(shù)最多，且莖稈粗壯，葉片綠色并富有光澤，有效地克服了玻璃化現(xiàn)象。雖然在苗高上遜于處理Ⅲ，但差異不顯著。因此處理I，即太陽(yáng)光+2 000 lx光照條件，更適宜篤斯越桔試管苗的增殖培養(yǎng)。

表7 不同光照強(qiáng)度試管苗生長(zhǎng)狀況

2.6 篤斯越桔生根培養(yǎng)基的篩選

正交試驗(yàn)表中K值越大，因子水平越高；R值越高(即極差范圍)，因子間差距越大。由表8可以看出，激素類(lèi)型和激素質(zhì)量濃度對(duì)生根率有顯著影響，培養(yǎng)方式對(duì)生根率影響不顯著。在1/2WPM(改良)培養(yǎng)基中添加激素NAA，篤斯越桔試管苗生根效果普遍不好，而在添加IBA的培養(yǎng)基中，篤斯越桔試管苗生根率普遍較高。另外，激素質(zhì)量濃度也很重要，激素質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1的試管苗生根率均高于同種激素的其它質(zhì)量濃度。綜上所述，篤斯越桔最適生根培養(yǎng)基為1/2WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1，最適生根培養(yǎng)方式為接種后首先放置于暗培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)10 d，隨后轉(zhuǎn)移到光照強(qiáng)度2 000 lx下培養(yǎng)30 d，生根率72%，且苗木生長(zhǎng)旺盛、根系粗壯。

表8 篤斯越桔試管苗生根培養(yǎng)正交試驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

在本研究中篤斯越桔優(yōu)良單株2015-Z的最佳外植體為帶芽莖段，不僅可以節(jié)省材料，且褐化率低、誘導(dǎo)率高，可在短時(shí)間內(nèi)繁育出大批的優(yōu)良苗木，同時(shí)可加速繁育效率，這與李冰[10]的結(jié)果一致。

掌握外植體的滅菌方法是獲得無(wú)菌苗的基礎(chǔ)，滅菌時(shí)間過(guò)短可致使細(xì)菌、霉菌滋生，出現(xiàn)大面積污染；滅菌時(shí)間太長(zhǎng)可造成酚污染，使試管苗生長(zhǎng)發(fā)育受限，嚴(yán)重可死亡。用清水將篤斯越桔外植體洗凈，然后用75%乙醇浸泡20 s、0.1%升汞浸泡3 min，用無(wú)菌水沖刷3次的滅菌效果最佳。這與邢玉春[11]對(duì)沉水植物所用的滅菌方法一致。

玉米素(ZT)質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1的改良WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化效果最佳，篤斯越桔試管苗分化系數(shù)10.8，分化率38%，試管苗生長(zhǎng)速度較快，苗高且壯。這與劉淑英[11]的研究結(jié)果一致。從篤斯越桔試管苗增殖率、增殖系數(shù)可以得出，玉米素對(duì)篤斯越桔增殖影響最大，起到了決定性作用?？梢?jiàn)，最佳增殖培養(yǎng)基應(yīng)為WPM(改良)+ IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1，增殖率92%，增殖系數(shù)20.40，此時(shí)幼苗健壯，生長(zhǎng)較旺盛，木質(zhì)化程度高。李冰[10]在篤斯越桔的研究中也得出質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1的ZT可以使不定芽莖變粗，葉片增大，增加體系的穩(wěn)定性。

強(qiáng)光照條件會(huì)抑制細(xì)胞增長(zhǎng)，進(jìn)而增進(jìn)細(xì)胞分化，試管苗株型緊湊，葉片為綠色；而弱光條件有助于細(xì)胞的增長(zhǎng)，同時(shí)延緩細(xì)胞分化，株高增加，出現(xiàn)徒長(zhǎng)現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)試管苗不同光照強(qiáng)度培養(yǎng)效果分析，發(fā)現(xiàn)利用太陽(yáng)光與日光燈混合的方式可以有效地促進(jìn)篤斯越桔試管苗增殖分化，并能控制苗木的徒長(zhǎng)。

篤斯越桔屬于較難生根的植物，通過(guò)對(duì)生根試驗(yàn)的結(jié)果分析，激素種類(lèi)是影響篤斯越桔生根率的最大因素，起決定性作用，其次就是激素質(zhì)量濃度。最適生根培養(yǎng)基為1/2WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1，適宜的生根方式是暗培養(yǎng)10 d，然后轉(zhuǎn)移到光照下(光照強(qiáng)度2 000 lx)培養(yǎng)30 d，試管苗的生根率達(dá)72%，且苗木生長(zhǎng)旺盛、根系粗壯。這與蘭士波[13]對(duì)野生篤斯越桔的研究一致，生根培養(yǎng)基都為1/2WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1。