李美瑩，李 前，金子涵，劉春萍，陸秀君

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

蒙古櫟Quercusmongolica是殼斗科Fagaceae櫟屬Q(mào)uercus落葉喬木，廣泛分布于寒溫帶、溫帶和暖溫帶[1]。蒙古櫟是國家二級(jí)珍貴樹種，同時(shí)也是我國東北地區(qū)主要的次生林樹種[2]。蒙古櫟具有很高的應(yīng)用價(jià)值，是我國主要的用材樹種之一；也可作為經(jīng)濟(jì)林樹種，木材可用來制作精美的葡萄酒桶[3]；同時(shí)蒙古櫟種實(shí)可提取單寧，具有良好的清熱解毒功效，藥用和食用價(jià)值較高[4]。

蒙古櫟生長周期長，結(jié)實(shí)晚，產(chǎn)量低，種子有大小年，良種匱乏。此外種子貯藏困難，容易受到多種昆蟲侵害，因此蒙古櫟種子園建立較為困難[5]。體細(xì)胞胚胎發(fā)生是木本植物大規(guī)模繁殖的重要方式之一[6]，具有繁殖速度快、數(shù)量多、能形成完整植株和再生率高等優(yōu)點(diǎn)[7]。近年來，關(guān)于櫟屬植株體細(xì)胞胚胎發(fā)生的報(bào)道有很多，Kim等[8]于1997年首次以生長在韓國的栓皮櫟Quercusvariabilis合子胚為外植體，成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚。張存旭[9]在2003年以陜西省栓皮櫟天然林中的未成熟合子胚為外植體成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚。2009年魏爽[10]以采集于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)天柱山的遼東櫟Q.liaotungensis未成熟合子胚為外植體成功誘導(dǎo)出體胚。廖婧[11]以麻櫟成熟合子胚為外植體成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚。張翠葉[12]以川滇高山櫟Q.aquifolioides未成熟合子胚為外植體成功進(jìn)行體胚誘導(dǎo)。但目前沒有關(guān)于蒙古櫟體細(xì)胞胚胎發(fā)生形成再生植株及體細(xì)胞胚胎發(fā)生最佳培養(yǎng)條件的研究報(bào)道。

本文對蒙古櫟體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行了初步研究，探究胚性愈傷組織的最佳誘導(dǎo)條件，旨在建立蒙古櫟體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系，獲得蒙古櫟再生植株，為工廠化育苗等提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2017年、2018年的6月25日至9月10日，分別在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)、遼寧省實(shí)驗(yàn)林場(撫順清原灣甸子鎮(zhèn))地車溝工區(qū)采集優(yōu)良蒙古櫟植株的未成熟種子。采集的種子放入4 ℃冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1 初代培養(yǎng)

1.2.1.1 最佳取材時(shí)間的確定

2018年6月25日至9月10日，每15 d在同一株母樹采集未成熟種子，設(shè)置6種取材時(shí)間。采集的未成熟種子在流水下沖洗1 h后移至超凈臺(tái)。用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3～5次，然后用0.1%升汞消毒12 min，并不斷地?fù)u動(dòng)瓶身，使外植體與消毒液充分接觸，最后用無菌水沖洗3～5次，用解剖刀切開種子，將下胚軸及胚根緊貼培養(yǎng)基的方式進(jìn)行接種。啟動(dòng)培養(yǎng)基選用MS+瓊脂6 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+水解酪蛋白0.5 g·L-1，添加激素2,4-D(0.1、0.5、1 mg·L-1)和6-BA(0、0.5、1、2 mg·L-1)。

1.2.1.2 適宜光照條件的篩選

將上述啟動(dòng)培養(yǎng)材料分別設(shè)置光照培養(yǎng)16 h·d-1(光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx)和全程暗培養(yǎng)。

1.2.1.3 種源對體胚誘導(dǎo)的影響

將8月下旬在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)、遼寧省實(shí)驗(yàn)林場(撫順清原灣甸子鎮(zhèn))地車溝工區(qū)采集未成熟蒙古櫟種子，分別標(biāo)記為種源1、種源2，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同上。

每種處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。觀察愈傷組織形態(tài)并統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率。

1.2.2 繼代培養(yǎng)

初代培養(yǎng)30 d后，選擇生長旺盛、顏色為乳黃色或乳白色的胚性愈傷組織，進(jìn)行繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配比篩選。以MS為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂6 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、水解酪蛋白0.5 g·L-1，添加NAA (0.1、0.5、1 mg·L-1)和6-BA(0、0.5、1、2 mg·L-1)。每種處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。30 d后觀察胚性愈傷組織增殖情況。

愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)量/接種的外植體總數(shù))×100%

體胚誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出體胚的外植體數(shù)量/接種的外植體總數(shù))×100%

1.2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度(23±2)℃，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx，光照時(shí)間16 h·d-1，培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel對所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄、統(tǒng)計(jì)，使用SPSS Statistics 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時(shí)間對初代培養(yǎng)的影響

不同取材時(shí)間對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)存在顯著影響(表1)?？傮w來看，以7月上旬采集的種子(合子胚大小約10 mm)為外植體，體胚誘導(dǎo)率最高85.7%。7月下旬到9月上旬外植體的體胚誘導(dǎo)率逐漸下降，8月開始產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間較長。因此，在體胚誘導(dǎo)過程中外植體應(yīng)選取7月上旬蒙古櫟未成熟合子胚。

表1 取材時(shí)期對體胚誘導(dǎo)的影響

2.2 不同激素配比對初代培養(yǎng)的影響

由表2可知，不同質(zhì)量濃度激素配比對體胚誘導(dǎo)差異顯著。當(dāng)只添加2,4-D時(shí)，體胚誘導(dǎo)率很低。隨著6-BA質(zhì)量濃度增加，體胚誘導(dǎo)率顯著提高，但當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度超過1 mg·L-1時(shí)，體胚誘導(dǎo)率開始下降；當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度逐漸增加時(shí)，體胚誘導(dǎo)率隨之上升。由此可知，添加2,4-D和6-BA可顯著提高體胚誘導(dǎo)率。因此蒙古櫟未成熟合子胚的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+水解酪蛋白0.5 g·L-1，誘導(dǎo)率77.7%。

表2 不同激素配比對體胚誘導(dǎo)的影響

2.3 光照條件對初代培養(yǎng)的影響

由圖1可知，蒙古櫟未成熟合子胚誘導(dǎo)出的愈傷組織有兩種狀態(tài)：光照培養(yǎng)下(圖1a、b)呈白色團(tuán)狀，表面滑膩，結(jié)構(gòu)緊密，多數(shù)易形成非胚性愈傷組織；暗培養(yǎng)下(圖1c)愈傷組織生長健壯，呈白色顆粒狀，可多次繼代增殖培養(yǎng)。

由表3可知，光照培養(yǎng)的體胚誘導(dǎo)率最高76.7%，暗培養(yǎng)的體胚誘導(dǎo)率最高77.7%，兩者差異不顯著。因此為獲取胚性愈傷組織，應(yīng)選用暗培養(yǎng)。

2.4 種源對初代培養(yǎng)的影響

不同種源均能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，但誘導(dǎo)率差異顯著(表4)。在激素配比為2,4-D 0.5 mg·L-1、6-BA 1 mg·L-1的條件下，種源2的誘導(dǎo)率最高49%，且高于種源1；其余3種處理下，種源1的誘導(dǎo)率均高于種源2，且2,4-D 1 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1的誘導(dǎo)率最高56.7%。由圖2可知，種源對愈傷組織的狀態(tài)也存在影響，種源2的未成熟合子胚(去子葉)在培養(yǎng)過程中容易褐化(圖2 a)，繼續(xù)培養(yǎng)容易變成結(jié)構(gòu)緊密的非胚性愈傷組織(圖2 b)。

注：a光照培養(yǎng)條件下愈傷組織結(jié)構(gòu)緊實(shí)；b光照培養(yǎng)條件下愈傷組織表面滑膩；c黑暗培養(yǎng)條件下愈傷組織顏色為白色，呈現(xiàn)出顆粒狀，結(jié)構(gòu)松散。

表4 不同種源對體胚誘導(dǎo)的影響

注：a種源2未成熟合子胚誘導(dǎo)的愈傷組織；b經(jīng)過繼代的種源2的未成熟合子胚誘導(dǎo)的愈傷組織。

2.5 不同激素配比對繼代培養(yǎng)的影響

從表5可以看出，在NAA 0.5 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1的激素配比下，培養(yǎng)14 d即可在白色顆粒狀愈傷組織(圖3 a)和褐色顆粒狀愈傷組織(圖3 b)的表面觀察到白色透明、大小不一的球形胚(圖3 c、d)，培養(yǎng)至第4周左右球形胚繼續(xù)生長發(fā)育變大、變多(圖3 e、f)，且體胚增殖率最大72.3%。當(dāng)激素質(zhì)量濃度過高時(shí)，在繼代培養(yǎng)過程中容易變?yōu)榘咨蚝稚o實(shí)結(jié)構(gòu)(圖3 i)的非胚性愈傷組織，在培養(yǎng)過程中不能繼續(xù)分化出球形胚(圖3 h)。

表5 NAA、6-BA對體胚增殖率的影響

3 結(jié)論與討論

7月上旬是蒙古櫟未成熟合子胚初代培養(yǎng)的最佳取材時(shí)期。最佳初代培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+水解酪蛋白0.5 g·L-1，誘導(dǎo)率85.7%。取材時(shí)間對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)有顯著差異；光照條件對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)差異不顯著，但暗培養(yǎng)下生長健壯，可多次培養(yǎng)。不同種源對胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著差異。最佳繼代培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+水解酪蛋白0.5 g·L-1，增殖率72.3%，且培養(yǎng)4周是最佳培養(yǎng)時(shí)間。

注：a白色顆粒愈傷組織上誘導(dǎo)出的球形胚；b褐色愈傷組織上誘導(dǎo)出的球形胚；c繼續(xù)培養(yǎng)白色顆粒愈傷組織上大小不同的球形胚；d繼續(xù)培養(yǎng)褐色愈傷組織上大小不同的球形胚；e球形胚聚集現(xiàn)象；f培養(yǎng)4周左右白色顆粒愈傷組織上誘導(dǎo)出的球形胚；g培養(yǎng)6周左右球形胚停止生長發(fā)育；h高濃度激素培養(yǎng)下產(chǎn)生的非胚性愈傷組織；i褐色團(tuán)狀非胚性愈傷組織。

影響蒙古櫟體胚誘導(dǎo)的原因諸多，如外植體、外源激素類型及配比、基因型以及培養(yǎng)環(huán)境等。本文主要研究了種源、未成熟合子胚取材時(shí)間、外源激素配比和光照條件對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響。植物激素是體胚誘導(dǎo)過程中關(guān)鍵的因素，由于2,4-D是體胚發(fā)生過程中的重要激素，可單獨(dú)使用也可配合細(xì)胞分裂素使用，所以大多數(shù)植株在誘導(dǎo)胚性愈傷組織時(shí)會(huì)選用2,4-D[13]。張濤[14]在研究蕓芥Erucasativa體細(xì)胞胚胎發(fā)生時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加2,4-D的培養(yǎng)基誘導(dǎo)蕓芥胚性愈傷組織的效果最佳，且2,4-D質(zhì)量濃度過高或過低都不利于體胚發(fā)生或增殖。6-BA屬于細(xì)胞分裂素，誘導(dǎo)速度快，誘導(dǎo)率高，單獨(dú)使用時(shí)多以直接體胚發(fā)生為主。張存旭[15]在栓皮櫟體胚誘導(dǎo)研究中同時(shí)加入NAA和6-BA兩種激素，愈傷組織質(zhì)地較好且多為胚性組織。本研究選擇2,4-D和6-BA配合使用，以間接體胚發(fā)生，能顯著提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。成功誘導(dǎo)胚性愈傷組織后繼代增殖，用NAA[16]代替2,4-D，并適當(dāng)降低質(zhì)量濃度，成功誘導(dǎo)出球形胚，這與魏爽[10]在遼東櫟體胚增殖階段的結(jié)果一致。但后續(xù)隨著繼代增殖次數(shù)增多，胚性愈傷組織的胚性能力下降，這與阿拉伯橡膠樹[17]體胚發(fā)生過程得出的結(jié)論非常相似。在今后的實(shí)驗(yàn)研究中，應(yīng)重點(diǎn)探究如何保持愈傷組織胚性并及時(shí)剔除非胚性愈傷組織，在愈傷組織胚性活力較強(qiáng)時(shí)轉(zhuǎn)入合適的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中[18]。

一般來說，分化程度低的組織更利于體胚誘導(dǎo)。研究表明，合子胚是誘導(dǎo)植物體胚發(fā)生最理想的材料，合子胚的取材時(shí)間對體胚誘導(dǎo)存在一定的影響。楊玲等[19]在研究花曲柳體胚誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)，未成熟合子胚的體胚誘導(dǎo)率明顯高于成熟合子胚。本研究表明，取材時(shí)期不但會(huì)影響誘導(dǎo)率，還會(huì)影響愈傷組織的質(zhì)地。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，7月上旬的體胚誘導(dǎo)率最高，該時(shí)期的外植體為未成熟合子胚，8月至9月上旬合子胚逐漸成熟，體胚誘導(dǎo)時(shí)間變長且誘導(dǎo)率逐漸下降，這與姚增玉[20]在栓皮櫟體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究的結(jié)果一致。此外本研究發(fā)現(xiàn)種源對體胚誘導(dǎo)影響差異顯著，可見基因型對體胚誘導(dǎo)的重要性。

光照條件對于體胚發(fā)生也有顯著影響，且不同植株對于光的敏感性也不同。有些植株在體胚誘導(dǎo)過程中需要光照，如青岡櫟Cyclobalanopsisglauca在體胚誘導(dǎo)時(shí)，只能在光下進(jìn)行，移至黑暗處則不再形成體胚[21]。而北美鵝掌楸Liriodendrontulipifera胚狀體在黑暗條件下發(fā)育健壯，在光下多形成畸形胚，且生長緩慢[22]。本研究中光照條件對體胚誘導(dǎo)率影響不顯著，但是在暗培養(yǎng)下愈傷組織生長更健壯，能長時(shí)間保持新鮮，而光下培養(yǎng)的愈傷組織容易發(fā)生褐化，多次繼代后易形成非胚性愈傷組織。但本研究在繼代增殖過程中只誘導(dǎo)出球形胚，對于繼代增殖的研究還有待于進(jìn)一步完善。