李蕾，何莉，蘇暢，梁昊，張秋雁，楊漾，謝輝，譚精培

血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞對心肌缺血模型大鼠缺血區(qū)血管新生的影響

李蕾，何莉，蘇暢，梁昊，張秋雁，楊漾，謝輝，譚精培

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

觀察血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞（EPCs）對心肌缺血模型大鼠缺血區(qū)血管新生的影響，探討其作用機制。采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支方法制備急性心肌缺血模型。實驗大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、他汀組和血府逐瘀湯低、中、高劑量組。造模后將熒光標記的EPCs尾靜脈注射植入模型大鼠體內(nèi)，成模后灌胃給藥，給藥第3日和第7日分別采血，取材缺血壞死部位肉芽組織和肌肉組織，行冰凍切片分析熒光表達，HE染色觀察樣本壞死病變情況，免疫組化檢測心肌組織CD106、CD146的表達，計數(shù)新生血管數(shù)量，硝酸還原酶法檢測血清和心肌缺血區(qū)一氧化氮（NO）表達。與模型組比較，血府逐瘀湯各劑量組均能促進EPCs遷移至大鼠心肌缺血區(qū)，提高CD106、CD146的表達，促進心肌缺血區(qū)血管新生，明顯升高血清和心肌組織NO含量，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01），血府逐瘀湯高劑量組效果最佳。血府逐瘀湯可誘導(dǎo)EPCs促進心肌缺血區(qū)血管新生，其作用機制與促進內(nèi)皮細胞CD106、CD146表達及升高血清和心肌組織NO水平有關(guān)。

血府逐瘀湯；內(nèi)皮祖細胞；血管新生；一氧化氮；大鼠

缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）是由于冠狀動脈循環(huán)改變引起的冠狀動脈血流供應(yīng)與心肌需求之間不能平衡所導(dǎo)致的心肌損害。在心肌缺血或梗死早期，毛細血管密度增加，壞死細胞釋放一系列促血管生成因子生成新的旁路，改善心肌的缺血狀態(tài)。內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是血管內(nèi)皮的前體細胞，在成體血管新生中發(fā)揮著重要作用[1]。在生理或病理因素等刺激下，EPCs從骨髓動員到外周血，在體內(nèi)缺血組織中整合形成新生血管的前體細胞，外源EPCs治療冠心病已從基礎(chǔ)研究推廣至臨床，能明顯改善心肌梗死和介入手術(shù)患者的預(yù)后[2-4]。血府逐瘀湯是治療缺血性心臟病的代表方，近年來，大量臨床和實驗研究表明，其具有較好的抗心肌缺血的作用[5]。中醫(yī)祛瘀生新理論是在活血化瘀基礎(chǔ)上的進一步認識和深化。其中，抗血小板、擴張冠狀動脈、改善血液流變等作用屬“祛瘀”之功，而促進血管新生則為“生新”之效。EPCs在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[6]。本實驗通過將熒光標記的EPCs尾靜脈注射植入急性心肌缺血模型大鼠體內(nèi)，探討血府逐瘀湯誘導(dǎo)EPCs參與心肌缺血區(qū)血管新生的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量220～240 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號43004700048705，動物許可證號SYXK（湘）2013-0005。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心清潔級動物房，溫度20～25 ℃，相對濕度55%～60%，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

血府逐瘀湯（當歸9 g，生地黃9 g，桃仁12 g，紅花9 g，枳殼6 g，牛膝9 g，川芎4.5 g，柴胡3 g，赤芍6 g，甘草6 g，桔梗4.5 g），飲片購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，加10倍量水浸泡0.5 h，加熱回流提取1 h，過濾，第2次加8倍量水，再煮1 h，合并2次煎液，濃縮至含原藥材0.78 g/mL。阿托伐他汀鈣片，浙江新東港藥業(yè)股份有限公司，批號20180605，配制成0.5 mg/mL混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

Rat骨髓細胞分離液（天津灝洋生物科技有限公司，貨號VE2012TARK），EGM-2培養(yǎng)基（瑞士LONZA公司，貨號CC-3162），NO試劑盒（南京建成生物科技有限公司，貨號A031-2），CD106一抗（英國Abcam公司，貨號ab134047），CD146一抗（美國Proteintech公司，貨號1756-1-AP）。臺式高速冷凍離心機（湘儀H1650R），全自動酶標洗板機（深圳匯松PW-812），多功能酶標分析儀（深圳匯松MB-530）。

2 實驗方法

2.1 骨髓源內(nèi)皮祖細胞原代分離及培養(yǎng)

大鼠脫頸處死后，分離四肢，剔除周圍肌肉組織，75%酒精浸泡5 min，無菌平皿中剪開骨兩端，2 mL無菌注射器吸取10%FBS DMEM高糖培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔。將所得細胞懸液過200目細胞濾網(wǎng)，400×離心5 min收集細胞。取新的離心管，依次加入分離液1、分離液2，制成梯度界面，吸管吸取細胞懸液加于分離液液面上，2000 r/min離心30 min。離心后，離心管中由上至下分為6層，吸管吸取第2層到另一15 mL離心管中，向該離心管中加入5 mL洗滌液，混勻細胞，1000 r/min離心10 min，棄上清液，吸管吸取培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，制成細胞懸液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，收集未貼壁細胞，換用EGM-2培養(yǎng)基接種于纖維連接蛋白（FN）包被的培養(yǎng)皿中。每3 d換液1次[7]。

2.2 免疫熒光鑒定內(nèi)皮祖細胞

細胞培養(yǎng)2周后，用胰酶消化細胞，接種于FN包被的爬片上，培養(yǎng)過夜后收集爬片，PBS洗2次；棄PBS后加入4%多聚甲醛，室溫固定20 min；PBS沖洗3次，每次5 min；0.3%TritonX-100通透30 min，再用PBS沖洗3次，每次5 min；用5%BSA 37 ℃封閉1 h；滴加適當稀釋的一抗（CD34），4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加100 μL抗兔-IgG標記熒光抗體，37 ℃孵育90 min，PBS沖洗3次，每次5 min；90%甘油封片；置于熒光顯微鏡下觀察。

2.3 熒光標記內(nèi)皮祖細胞

胰酶消化EPCs，無血清EGM-2培養(yǎng)基重懸細胞，制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×106/管；取2 μL PKH26溶液，用試劑盒自帶稀釋液稀釋至500 μL，重懸細胞，混勻，37 ℃孵育5 min；加入100 μL血清終止，完全培養(yǎng)基洗細胞2次。

2.4 心肌缺血模型建立

大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，行氣管插管，連接小動物呼吸機，觀察并記錄心電圖變化。于左前第4/5肋間開胸，逐層鈍性分離，置入2個小型拉鉤，向兩邊拉開肋骨，暴露心臟，撕開心包膜，輕提左心耳，充分暴露肺動脈圓錐，以左心耳和肺動脈圓錐交界處的左冠狀動脈主干為標志，用6/0無創(chuàng)縫合絲線穿過心耳下緣的心肌淺層，結(jié)扎冠狀動脈左前降支。結(jié)扎后心室壁顏色變暗，心電圖可見ST段抬高伴肢導(dǎo)聯(lián)R波高尖為結(jié)扎成功的標志。術(shù)后青霉素肌注連續(xù)3 d，預(yù)防感染。

2.5 分組及給藥

心肌缺血大鼠模型制備后，將“2.3”項下熒光標記的EPCs以5×106/mL，尾靜脈注射1 mL細胞懸液入模型鼠體內(nèi)，并于造模后第2日給藥。大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、他汀組和血府逐瘀湯高、中、低劑量組（中藥高、中、低劑量組）。正常組不施加任何干預(yù)，假手術(shù)組只在左前降支穿線不打結(jié)，模型組給予生理鹽水20 mL/（kg?d）灌胃，他汀組腹腔注射阿托伐他汀混懸液0.3 mg/（kg?d），中藥低、中、高劑量組分別給予血府逐瘀湯藥液3.9、7.8、15.6 g/（kg?d）灌胃，給藥體積20 mL/kg，連續(xù)7 d。

2.6 標本采集

給藥第3日和第7日采血，分離血清，置于-20 ℃保存，第7日處死大鼠，開胸后取出心臟，取一等份缺血壞死部位肉芽組織和肌肉組織，OCT包埋，冰凍切片，一等份心肌組織，4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，制成厚約5 μm組織切片。

2.7 指標檢測

2.7.1 內(nèi)皮祖細胞遷移分布檢測

將樣本用OCT包埋，冰凍切片；將切片置于冰丙酮中固定15 min，蒸餾水水洗；切片置蒸餾水中脫膠30 min；DAPI工作液37 ℃染核10 min，PBS沖洗3次，每次5 min；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，每個樣本隨機選取6個視野，分析各視野熒光強度，取其均數(shù)作為該樣本的熒光強度。

2.7.2 心肌組織病理觀察

60 ℃烤片1～2 h；將切片置于二甲苯中10 min×2次，然后依次置于100%、 95%、85%、75%梯度乙醇，每級5 min，再用蒸餾水浸洗5 min；蘇木素染色約30 s，蒸餾水沖洗，PBS返藍；伊紅染色約30 s，蒸餾水沖洗；梯度乙醇（95%～100%）脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯中10 min×2次，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

2.7.3 免疫組化檢測心肌組織CD106、CD146的表達和血管計數(shù)

60 ℃烤片30 min；置于二甲苯中10 min×2次，再依次置于100%、95%、85%、75%乙醇，每級放置5 min，再用蒸餾水浸洗5 min；將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），微波爐加熱至沸騰后斷電，連續(xù)煮15 min后，冷卻15 min取出，冷卻至室溫，0.01 mol/L PBS（pH 7.2～7.6）洗滌3次，每次3 min；加入3%H2O2，室溫10 min，以滅活內(nèi)源性酶，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加適當稀釋的一抗（CD106，CD146），4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加50～100 μL抗兔-IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加預(yù)制好的顯色劑工作液50～100 μL，室溫孵育1～5 min，鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水洗滌；蘇木素復(fù)染10 s左右，蒸餾水沖洗，PBS返藍；各級乙醇（60%～100%）脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陽性染色為黃色或棕黃色（深可至褐色）。每張組織切片400倍下攝取6個視野，運用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件對圖片進行分析，計算相同面積內(nèi)相關(guān)指標陽性表達的積分光密度（IOD值）。每個樣本在400倍鏡下隨機選取6個視野計數(shù)血管，以均值作為該樣本的新生血管數(shù)量。

2.7.4 血清和心肌缺血區(qū)一氧化氮含量測定

腹主動脈取血，離心，取上清液，硝酸還原酶法測定血清和心肌缺血區(qū)NO含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 血府逐瘀湯對模型大鼠內(nèi)皮祖細胞遷移的影響

熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，藍色是DAPI染核信號，紅色熒光是EPCs陽性染色信號。與模型組比較，他汀組和中藥低、中、高劑量組紅色熒光信號明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01，＜0.05）；他汀組熒光信號較中藥各劑量組明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01，＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥中、高劑量組熒光信號明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組紅色熒光信號明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。表明血府逐瘀湯能促進EPCs遷移至大鼠心肌缺血區(qū)，與藥物濃度呈正相關(guān)。結(jié)果見表1、圖1。

4.2 病理觀察結(jié)果

正常組和假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列整齊，可見橫紋，細胞間隙均勻；模型組大鼠可見梗死灶，心肌細胞排列紊亂，細胞水腫變性，間質(zhì)變寬，心肌細胞纖維化，大量炎性細胞浸潤；中藥低劑量組大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞水腫，可見炎性細胞；中藥中、高劑量組和他汀組大鼠心肌細胞排列較為規(guī)則，部分細胞輕度水腫，變性明顯減輕，中藥高劑量組大鼠心肌細胞變性壞死程度最輕。結(jié)果見圖2。

表1 各組大鼠心肌組織EPCs熒光表達比較（±s）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，△＜0.05，△△＜0.01；與他汀組比較，▲＜0.05，▲▲＜0.01；與中藥低劑量組比較，◇＜0.05，◇◇＜0.01；與中藥中劑量組比較，◆◆＜0.01

4.3 血府逐瘀湯對模型大鼠心肌組織CD106、CD146表達的影響

鏡下觀察顯示，新生血管陽性信號為黃色或棕色染色（深可至褐色）。正常組和假手術(shù)組大鼠心肌組織CD106呈弱陽性表達；模型組可見中等量CD106陽性染色，染色稍深；中藥低劑量組和中藥中劑量組大鼠心肌組織CD106陽性染色進一步加深，可見棕色顆粒；中藥高劑量組和他汀組大鼠心肌組織CD106呈強陽性染色，可見大量棕褐色顆粒，見圖3。CD146在正常組和假手術(shù)組表達量較少；模型組呈弱陽性表達，散在分布，染色較淺；中藥低劑量組和中藥中劑量組大鼠心肌組織可見中等量CD146陽性染色，染色變深，可見很多深棕色顆粒；他汀組可見CD146陽性染色，染色進一步加深；中藥高劑量組CD146呈強陽性染色，陽性表達量明顯高于模型組、中藥低劑量組和中藥中劑量組。見圖4。與正常組比較，模型組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，他汀組和中藥中、高劑量組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達顯著升高（＜0.01）；與他汀組比較，中藥各劑量組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達明顯下降（＜0.01，＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥中、高劑量組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達明顯升高（＜0.01）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達明顯升高（＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達比較（±s，IOD值）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，△△＜0.01；與他汀組比較，▲▲＜0.01；與中藥低劑量組比較，◇◇＜0.01；與中藥中劑量組比較，◆＜0.05

4.4 血府逐瘀湯對模型大鼠新生血管數(shù)量的影響

正常組與假手術(shù)組大鼠新生血管數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；與正常組比較，模型組大鼠新生血管數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，他汀組和中藥中、高劑量組大鼠新生血管數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與他汀組比較，中藥各劑量組大鼠血管數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與中藥低劑量組比較，中藥中、高劑量組大鼠新生血管數(shù)量明顯增加（＜0.01）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組大鼠血管數(shù)量明顯增加（＜0.05）。結(jié)果見表3。

4.5 血府逐瘀湯對模型大鼠血清和心肌組織一氧化氮含量的影響

正常組與假手術(shù)組大鼠NO含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；與正常組比較，模型組大鼠血清和心肌組織NO含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，他汀組和中藥中、高劑量組大鼠血清和心肌組織NO含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與他汀組比較，中藥低、中劑量組大鼠血清和心肌組織NO含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01，＜0.05），中藥高劑量組NO含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組NO含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01，＜0.05），中藥中劑量組NO含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組大鼠血清和心肌組織NO含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表4。

表3 各組大鼠新生血管數(shù)量比較（±s，個）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，△△＜0.01；與他汀組比較，▲▲＜0.01；與中藥低劑量組比較，◇◇＜0.01；與中藥中劑量組比較，◆＜0.05

表4 各組大鼠血清和心肌組織NO含量比較（±s，μmol/L）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，△△＜0.01；與他汀組比較，▲＜0.05，▲▲＜0.01；與中藥低劑量組比較，◆＜0.05，◆◆＜0.01

5 討論

IHD屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇。血府逐瘀湯是活血化瘀經(jīng)典方。方中桃仁破血行滯而潤燥，紅花活血祛瘀以止痛，共為君藥；赤芍、川芎助君藥活血化瘀，牛膝引瘀血下行，使血不郁于胸中，痰熱不上擾。該方配伍嚴謹，既能行血分瘀滯，又能解氣分郁結(jié)；活血不耗血，行氣不傷陰；能夠升達清陽，降泄下行，使氣血調(diào)和。

心肌缺血后會激發(fā)自身血管新生機制，毛細血管密度增加，釋放多種促血管生成因子，形成新的旁路循環(huán)，但仍不足以代償缺血造成的血流損失和使血管恢復(fù)到正常生理功能。因此，盡早恢復(fù)供血，促進新的血管生成是修復(fù)損傷的關(guān)鍵所在。

EPCs能增殖和分化成為血管內(nèi)皮的前體細胞，修復(fù)受損傷的內(nèi)皮。通過對缺血區(qū)的新生血管數(shù)量進行測定、分析比較發(fā)現(xiàn)，與正常組和模型組比較，中藥各劑量組新生血管數(shù)量明顯增多，中藥高劑量組新生血管數(shù)量最多。對缺血心肌組織進行病理觀察發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組可見大面積梗死灶，心肌細胞纖維化，間質(zhì)增寬；與模型組比較，中藥高劑量組心肌細胞結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列較規(guī)則，少量炎性細胞浸潤，中藥高劑量組變性程度最輕。提示高劑量血府逐瘀湯能促進新的血管生成，保護和修復(fù)缺血損傷的心肌。本實驗免疫組化結(jié)果顯示，內(nèi)皮細胞CD106和CD146呈陽性表達，表明其參與了受損內(nèi)皮的修復(fù)，且隨著給藥濃度的增加，陽性表達率增高，進一步證實其在生理和病理性血管生成中的作用。

血管新生受到眾多信號調(diào)控，其中NO在調(diào)控體系中發(fā)揮極大作用。NO能動員骨髓EPCs釋放進入外周血。為進一步了解血府逐瘀湯誘導(dǎo)遷移的機制，本實驗選擇在動員EPCs和提高循環(huán)EPCs數(shù)量方面發(fā)揮重要作用的血管舒張因子NO作為切入點，結(jié)果顯示，血府逐瘀湯能提高血清和心肌組織NO含量，結(jié)合相應(yīng)的熒光表達情況，表明在血府逐瘀湯誘導(dǎo)EPCs遷移至心肌缺血區(qū)，促進血管新生，修復(fù)缺血損傷的過程中，NO可能是發(fā)揮關(guān)鍵作用的因素之一。

綜上，血府逐瘀湯可誘導(dǎo)EPCs促進心肌缺血區(qū)血管新生，其作用機制與促進內(nèi)皮細胞CD106、CD146表達及血清、心肌組織NO水平有關(guān)。

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Effects of Endothelial Progenitor Cells Induced byDecoction on Angiogenesis of Ischemic Region in Rats with Myocardial Ischemia

LI Lei, HE Li, SU Chang, LIANG Hao, ZHANG Qiuyan, YANGYang, XIE Hui, TAN Jingpei

To observe the effects of endothelial progenitor cells (EPCs) induced byDecoction on angiogenesis in ischemic region of rats with myocardial ischemia; To explore its mechanism.Acute myocardial ischemia model was prepared by ligating the left anterior descending coronary artery. Experimental rats were randomly divided into normal group, sham-operation group, model group, atorvastatin group,Decoction low-, medium-, and high-dosage groups. After successful modeling, fluorescently labeled EPCs were injected into the model mice by tail vein injection. After modeling, the rats received gavage. On the 3rd and 7th day after administration, blood was collected and the granulation tissue and muscle tissue of the ischemic necrosis were taken. The fluorescence expression was analyzed by frozen section. HE staining was used to observe the necrotic lesions of each group and count the number of local blood vessels. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of CD106 and CD146 in neovascularization. NO expression levels in serum and myocardial ischemic areas were determined by nitrate reductase assay.Compared with model group,Decoction groups could promote the migration of EPCs to myocardial ischemia area in rats, increase the expressions of CD106 and CD146, promote angiogenesis in myocardial ischemic area, and significantly increase the NO content in serum and ischemic tissue, with statistical significance (<0.01), and the high-dosage group achieved the best efficacy.Decoction can induce EPCs to promote angiogenesis in myocardial ischemic area. The mechanism of action is related to the promotion of endothelial cell CD106 and CD146, as well as the expression of NO in serum and myocardial tissue.

Decoction; endothelial progenitor cells; angiogenesis; NO; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)02-0069-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202006290

國家自然科學(xué)基金（81574039、81503627）

張秋雁，E-mail：1746821852@qq.com

（收稿日期：2020-06-15）

（修回日期：2020-07-13；編輯：華強）