莫嘉浩，許洪彬，李菁，李金生，綦向軍，鐘崇

基于網絡藥理學的左金丸治療肝癌機制探討

莫嘉浩1，許洪彬1，李菁2，李金生3，綦向軍4，鐘崇5

1.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；3.廣州中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；4.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；5.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

運用網絡藥理學研究左金丸治療原發(fā)性肝癌的作用機制。通過中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）獲取左金丸的化合物及靶點，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為閾值進行化合物篩選，將靶點輸入Uniprot獲取靶點對應的基因Symbol；從人類基因數據庫（GeneCards：The Human Gene Database）獲取原發(fā)性肝癌的疾病基因，并篩選出與左金丸靶點基因的交集基因；運用Cytoscape3.7.1軟件繪制活性成分-靶點、疾病-中藥-化合物-交集靶點（基因）網絡圖；運用String構建蛋白相互作用網絡，運用g:Profiler數據分析平臺進行GO富集及KEGG通路富集分析；聯合主要化合物、交集基因與通路分析結果，繪制成分-靶點-通路網絡圖。篩選得到左金丸化合物41種、交集基因111個，剔除不含交集基因（靶點）的化學成分后得到化合物31種，槲皮素、黃連素、吳茱萸堿等為左金丸的主要活性成分，AKT1、TP53、HSP90AA1等為主要作用靶點。GO富集分析共獲得條目136條，涉及細胞因子受體結合、核受體結合、調控序列特異性DNA結合等多個生物過程，KEGG富集分析得到165條通路。左金丸通過多靶點調控PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎通路、IL-17信號通路等治療原發(fā)性肝癌。經生物信息學的基因芯片驗證，結果基本相符。

左金丸；原發(fā)性肝癌；網絡藥理學；信號通路

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）指發(fā)生于肝細胞或肝內膽管細胞的惡性腫瘤[1]，全球病死率居惡性腫瘤第三位[2]。2015年報道，我國肝癌發(fā)病率為466.1/10萬，病死率為422.1/10萬[3]。因其具有發(fā)病隱匿、進展迅速、復發(fā)快、預后差等特點[4]，故防治是臨床研究重點。

左金丸出自《丹溪心法》，由黃連、吳茱萸組成，主要用于肝火犯胃之嘔吐、脅痛等。藥理學研究表明，其水煎液可通過阻斷AP-1等通路有效抑制肝癌細胞HepG2的增殖，也可通過誘導線粒體凋亡以抗癌[5-6]。有miRNA網絡機制研究發(fā)現，黃連、吳茱萸的主要有效成分黃連素與吳茱萸堿聯用具有抗癌作用[7]。目前雖已確認黃連素和吳茱萸堿分別為黃連、吳茱萸的抗腫瘤活性成分[8]，但中藥成分復雜，靶點眾多，尚需進一步分析?，F有研究認為，左金丸作用靶點可能涉及癌癥、肝病、代謝、炎癥等，與癌癥尤為相關[8]，但針對特定疾病的網絡藥理學研究仍欠缺。本研究運用網絡藥理學的多成分、多靶點、多通路分析方法，全面闡釋左金丸治療肝癌的機制。

1 資料與方法

1.1 左金丸化合物與靶點獲取

運用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp. nwu.edu.cn/tcmsp.php）分別查找黃連、吳茱萸，獲取相應的化合物。以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為條件進行化合物篩選，以提高數據的真實可靠性[10-13]。運用TCMSP查找所得化合物對應的靶點信息，將結果輸入Uniprot（http://www.uniprot.org/），獲取靶點對應的基因Symbol。

1.2 肝癌疾病基因獲取

以“hepatocellular carcinomas”“l(fā)iver cancer”“hepatoma”“hepatic cancer”“hepatic carcinoma”為關鍵詞，從人類基因數據庫（GeneCards：The Human Gene Database，https://www.genecards.org/）獲取肝癌的疾病基因，與左金丸的靶點基因對比后篩選出二者的交集基因。GeneCards數據庫集合已得到實驗驗證、組學檢測驗證的基因與疾病關系信息，具有全面性、權威性，并通過GIFtS算法對基因-疾病的相關度進行排序[14]，其Relevance score有助于從特定疾病對應的諸多靶點中篩選出相關度更高的靶點[15]。設置Relevance score≥10，提取高關聯度靶點基因。

1.3 活性成分-靶點、疾病-中藥-化合物-交集靶點（基因）網絡構建

獲取交集基因后，對化合物進行反向篩選，剔除靶點基因中不含交集基因的化合物，運用Cytoscape3.7.1軟件繪制活性成分-靶點、疾病-中藥-化合物-交集靶點（基因）網絡圖，并采用該軟件的network analyzer模塊進行網絡拓撲學分析。

1.4 蛋白相互作用網絡構建

將所得交集基因輸入String數據分析平臺（https://string-db.org/）進行蛋白相互作用（protein- protein interaction，PPI）網絡分析，分析模式設定為“Multiple proteins”，物種限定為“Homo sapiens”。對數據進行預讀后，設置置信度≥0.99，并隱藏孤立蛋白，最后輸出PPI網絡圖。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

運用g:Profiler數據分析平臺（https://biit.cs.ut.ee/ gprofiler/gost）進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，將物種限定為“Homo sapiens”，采用g:SCS算法進行值的校正。g:SCS算法是g:Profile團隊開發(fā)的用于計算GO和KEGG富集分析所得值的多重測試校正方法，與Bonferroni及False Discovery Rate等校正方法相比，該算法考慮到每個生物體術語注釋下的潛在基因集合結構，提供了一個更為嚴謹的閾值[7]，篩選校正后＜0.05的富集結果。運用Excel2010進行數據可視化，R軟件繪制靶點-通路干預機制圖。

1.6 成分-靶點-通路網絡

結合主要成分、核心靶點與KEGG分析所得通路，運用Cytoscape3.7.1軟件繪制成分-靶點-通路網絡圖，分析其整體關聯。

1.7 肝癌基因樣本獲取

為進一步驗證基因的準確性，以“hepatocellular carcinomas”“l(fā)iver cancer”“hepatoma”“hepatic cancer”為關鍵詞，檢索美國國立生物技術信息中心（NCBI）的GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），篩選有關人類肝癌基因的實驗數據。然后使用R軟件（3.6.1）中的affy軟件包（1.62.0），將mRNA的原始數據轉換成可識別格式，通過Robust-Multi-Array（RMA）方法進行背景矯正和標準化處理，最終得到標準化后的表達值矩陣，用于后續(xù)的差異表達分析。

1.8 篩選并驗證差異表達基因

利用R軟件中l(wèi)imma函數包篩選肝癌樣品中的差異表達mRNAs。篩選閾值為＜0.05和|log2FC|＞0.5，繪制火山圖，并在樣品中進行差異表達mRNAs的雙向聚類分析。將差異基因與左金丸基因取交集，再與研究結果的肝癌-左金丸交集基因結果對比，驗證準確性。

2 結果

2.1 左金丸化學成分及靶點

以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，共獲得左金丸活性成分44種，其中黃連14種、吳茱萸30種，去除重復成分后共41種。轉換后得到靶點基因黃連287個、吳茱萸330個，去除重復后得到靶點基因187個。從GeneCards數據庫獲得肝癌疾病基因共8567種，高關聯度靶點基因1196個。對疾病靶點和左金丸靶點經人工校對后取交集，獲得基因111個，剔除不含交集基因（靶點）的化學成分，得到相關化學成分31種，其中黃連7種、吳茱萸22種，二者共有成分2種，見表1。

2.2 可視化網絡構建

2.2.1 活性成分-靶點網絡

采用Cytoscape3.7.1軟件對左金丸中具有靶點的化合物及其對應靶點構建可視化網絡，結果見圖1。該網絡共142個點，包括化合物31個、靶點基因111個，其相互作用用連線表示。利用Cytoscape軟件Network Analyzer插件中的Visualize Parameters對網絡進行處理，節(jié)點大小代表Degree的大小，邊的粗細代表Edge Betweenness的大小。其中5個靶點基因Degree＞20，提示這些靶點基因可能在左金丸中起主要藥效作用。

2.2.2 疾病-中藥-化合物-交集靶點網絡

采用Cytoscape3.7.1軟件繪制左金丸治療肝癌疾病-中藥-化合物-交集靶點（基因）網絡，結果見圖2。

注：黃色代表化合物，紫色代表靶點基因

注：綠色代表交集基因，黃色代表化合物；左下方為Degree＜3的集合，右下方為Degree≥3的集合

2.3 蛋白相互作用網絡

將左金丸治療肝癌的靶點基因導入String11.0數據庫進行分析，PPI網絡見圖3。62個蛋白存在85條相互作用關系。將PPI網絡導入Cytoscape3.7.1軟件并利用cytoHubba插件分析網絡中基因的重要性，排名前20位的關鍵基因見表2。

表2 左金丸治療肝癌的關鍵基因（前20位）

2.4 GO功能富集分析

GO功能富集分析共獲得符合篩選標準的條目136條，對富集基因數前20位的條目進行可視化，以條形的長度代表相應條目所富集基因數，結果見圖4。

2.5 KEGG通路富集分析

對左金丸治療肝癌的111個基因進行KEGG通路富集分析，值排序前10位的通路見表3，前20位通路富集氣泡圖見圖5。此外，對KEGG結果進行預讀后發(fā)現，與肝癌密切相關的通路有PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎通路、丙型肝炎通路，運用R軟件加載Bioconductor包對PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎通路、IL-17信號通路進行靶點-通路機制分析，以紅色標記代表左金丸可能進行干預的潛在靶點，結果見圖6～圖8。

表3 左金丸治療肝癌基因KEGG通路富集（前10位）

圖4 左金丸治療肝癌基因GO功能富集條形圖（前20位）

圖5 左金丸治療肝癌基因KEGG通路富集氣泡圖（前20位）

圖6 左金丸治療肝癌乙型肝炎通路分析

圖7 左金丸治療肝癌IL-17信號通路分析

圖8 左金丸治療肝癌PI3K-Akt信號通路分析

2.6 成分-靶點-通路網絡

通過文獻檢索與閱讀，在前20位的KEGG通路中篩選出可能與肝癌相關的通路，并將其與左金丸的活性成分、作用靶點結合，構建成分-靶點-通路多維網絡，結果見圖9。

注：黃色代表藥物，藍色代表與肝癌相關的活性成分，綠色代表潛在靶點，紫色代表與肝癌相關通路

2.7 肝癌基因樣本

符合條件的基因表達數據集為GSE54238，包括10個正常樣本和13個肝癌樣本，檢測平臺為GPL16955（Arraystar human lncRNA microarray V1-100309）。

2.8 差異表達基因驗證

篩選后得到差異表達的mRNAs共2382個，其中表達上調1182個，表達下調1200個，組間差異火山圖見圖10。差異基因與左金丸基因取交集后得到29個交集基因，與“2.1”項下交集基因對比，共18個基因重疊，包括AKT1、AR、CCNA2、CCNB1、CDK2、CTSD、CYP3A4、E2F1、EGFR、FOS、HSP90AA1、KDR、NR1I2、ODC1、PON1、RXRA、STAT1、TP53。經對比驗證，該18個基因為左金丸-肝癌關鍵基因，亦位于前述PPI網絡圖中核心位置。

圖10 肝癌差異表達mRNA火山圖

3 討論

左金丸有瀉肝火、開痞結之功，其中黃連燥濕瀉火解毒，吳茱萸溫中散寒止痛，二者相配，寒熱并用，辛開苦降，使肝火得清，胃氣得降，濕邪得化。

本研究借助TCMSP平臺，篩選得到左金丸活性成分41種，藥物靶點基因187個；將其對應的靶點與肝癌的疾病靶點進行對比，獲得交集基因111個，篩選得到潛在化合物31種，其中部分化合物的有效性及作用機制已被證實。黃連、吳茱萸均富含檞皮素和黃連素。槲皮素是一種強大的自由基清除劑，能抑制人體內肝癌細胞株SMMC-7721的增殖[16]，國外研究發(fā)現其可調節(jié)TP53以抑制肝癌細胞增殖[17]，與本研究PPI網絡所得關鍵基因靶點結果一致。黃連素主要通過AMP-活化蛋白激酶促進肝癌細胞凋亡[18]，一項關于黃連素干預肝癌細胞的研究顯示，黃連素可通過上調葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）選擇性促進肝癌細胞自噬性死亡，并發(fā)現AFT6很可能是黃連素的新靶點[19]。黃連中OB值最高的化合物巴馬汀可通過抑制細胞凋亡和調節(jié)細胞因子反應以減輕小鼠肝損傷程度[20]，體外實驗也證實其具有抗癌活性[21]。吳茱萸中OB值最高的吳茱萸堿可通過促進腫瘤壞死因子（TNF-α）的生成和調節(jié)細胞周期變化而發(fā)揮抗癌作用[22]，TNF是Degree≥3的重要基因靶點之一。吳茱萸主要活性成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿、羥基吳茱萸堿等均屬于生物堿類化合物，具有抗腫瘤作用[23]。上述化合物多數具有較高的度值，位于左金丸治療肝癌疾病-中藥-化合物-交集靶點（基因）網絡的核心，提示這些化合物對應的靶點基因可能在左金丸抗肝癌過程中起主要作用。

活性成分與交集靶點基因PPI網絡可確定核心治療靶點。AKT1、TP53、CDKN1A、HSP90AA1等是左金丸治療肝癌的核心靶點。AKT是PI3K-Akt信號通路的重要橋梁點[24]，而PI3K-Akt信號通路被越來越多的研究證明在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用[25-27]，也是本研究KEGG通路富集結果中計數最多的通路。有研究顯示，TP53突變在HBV感染導致的肝癌中有重要意義[28]，其HBV致癌通路也是本研究的KEGG通路富集結果之一。CDKN1A編碼一種蛋白依賴性的激酶抑制劑，編碼的蛋白可阻滯細胞周期于G1期，CDKN1A表達受抑癌蛋白p53的嚴格控制，有研究發(fā)現其可聯合端粒酶以抑制腫瘤增殖[29]。HSP90AA1居于PPI網絡中心區(qū)域，有研究發(fā)現其在中重度抑郁組肝癌患者中呈現高表達[30]，且與肝癌患者的腫瘤臨床分期存在一定相關性[31]。

本研究經PPI網絡確定核心靶點后，進行GO功能富集分析以探討其具體的功能作用，結果主要集中在細胞因子受體結合、核受體結合、調控序列特異性DNA結合等過程。此外，泛素樣蛋白連接酶結合（ubiquitin-like protein ligase binding，adj＝3.68×10-9）、血紅素結合（heme binding，adj＝4.55×10-9）等亦為重要的生物過程，參與抑制癌細胞增殖，預防肝臟癌細胞轉移進展[32-33]。

本研究通過KEGG通路富集分析追蹤左金丸治療肝癌的代謝通路，并作成分-靶點-通路網絡分析整體聯系。結果發(fā)現，左金丸主要作用于PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎通路、IL-17信號通路、丙型肝炎通路。PI3K-Akt信號通路參與細胞的生長、存活、增殖、凋亡等過程，對多種癌癥具有重要的調控作用[34]，其以AKT靶點為樞紐，抑制PI3K-Akt信號通路中AKT表達，從而抑制肝癌細胞遷移和侵襲[35]，而AKT在左金丸治療肝癌PPI網絡中有重要地位。在乙型肝炎通路圖中可見左金丸對其中的肝癌侵襲轉移通路（HCC invasion and metastasis）、肝癌發(fā)展通路（HCC development）等進行調節(jié)，靶點基本占據通路的重要節(jié)點。IL-17是一種與固有性及適應性免疫應答相關的細胞因子，IL-17升高與肝癌的發(fā)生、發(fā)展呈正相關[36]，動物實驗表明IL-17可通過拮抗γ-干擾素促進肝癌細胞的生長[37]。左金丸治療肝癌IL-17信號通路圖中，左金丸的作用靶點基本覆蓋IL-17通路各段，可見，IL-17的調節(jié)與肝癌的發(fā)生發(fā)展有密切聯系，有助于驗證相關臨床研究[37]。成分-靶點-通路網絡圖顯示，槲皮素（MOL000098，quercetin）的化合物-藥物、化合物-靶點關聯度最高，與潛在核心化合物挖掘結果相符，可進一步證實其為左金丸治療肝癌的核心活性成分。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學分析結合文獻發(fā)現，槲皮素、黃連素、吳茱萸堿為左金丸的主要活性成分，經基因芯片驗證，核心靶點以AKT1、TP53、HSP90AA1等為主，涉及細胞因子受體結合、核受體結合、調控序列特異性DNA結合等多個生物過程，并通過調控PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎通路、IL-17信號通路發(fā)揮抗癌作用。本研究對闡明左金丸治療肝癌及預防其轉移的作用機制具有借鑒意義，但結論仍待進一步實驗和臨床研究驗證。

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Discussion on Mechanism ofPills in Treatment of Hepatocellular Carcinoma Based on Network Pharmacology

MO Jiahao1, XU Hongbin1, LI Jing2, LI Jinsheng3, QI Xiangjun4, ZHONG Chong5

To study the mechanism ofPills in the treatment of hepatocellular carcinoma based on network pharmacology.The compounds and targets ofPills were obtained by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). The compounds were screened by oral bioavailability (OB) ≥30% and drug-like (DL) ≥0.18 as thresholds, and the targets were input into Uniprot to obtain the gene Symbol. The disease target genes of hepatocellular carcinoma were obtained from GeneCards: The Human Gene Database, and intersection genes of target genes ofPills were screened. Cytoscape3.7.1 software was used to draw network diagrams of active ingredient-target and disease-TCM-compound-intersection target (gene). The protein-protein interaction relationship network was constructed by String. GO enrichment and KEGG pathway enrichment were analyzed by g:Profiler data analysis platform. Combined with the analysis resultsof major compounds, intersection genes and pathways, the component-target-pathway network diagram was drawn.Totally 41 compounds and 111 intersection genes ofPills were obtained and chemical components without intersection genes (targets) were removed, and 31 compounds were finally screened. Quercetin, berberine, evodia rutaecarpa alkali were the main active ingredients ofPills, and AKT1, TP53, HSP90AA1 were the main targets. After GO enrichment analysis, a total of 136 items meeting the screening criteria were obtained, involving multiple biological processes such as cytokines involved in receptor, nuclear receptors, regulatory sequence specific DNA binding, and 165 were obtained by KEGG enrichment analysis.Pills can control PI3K-Akt signal pathway, hepatitis B, and IL-17 signal pathway to treat hepatocellular carcinoma. The results are basically consistent through bioinformatics gene chip verification.

Pills; hepatocellular carcinoma; network pharmacology; pathway

R273.57；R285.5

A

1005-5304(2021)02-0019-09

10.19879/j.cnki.1005-5304.202001256

國家自然科學基金（81873303）；湖南省自然科學基金（2016JJ6113）；湖南省衛(wèi)生健康委科研計劃項目（20200949）；湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學一流學科開放基金（2018ZYX51）

李菁，E-mail：lilee2711@sina.com

（收稿日期：2020-01-16）

（修回日期：2020-02-05；編輯：陳靜）