方 艷, 武 康, 趙冰冰, 汪家權(quán)

(合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

目前, 巢湖治理藍(lán)藻 (主要是微囊藻、念珠藻和魚腥藻等幾種混合藻) 爆發(fā)的重要應(yīng)急措施依舊是傳統(tǒng)的機(jī)械和人工打撈[1], 藍(lán)藻在生長(zhǎng)過程中吸收了湖泊中大量的氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),打撈藍(lán)藻可以將水體的氮磷帶走,而這種不經(jīng)過恰當(dāng)處理打撈上岸的藍(lán)藻會(huì)造成二次污染[2]。經(jīng)過研究者對(duì)巢湖藍(lán)藻的分析可知,其中藻藍(lán)蛋白的含量達(dá)5%以上[3],高純度的藻藍(lán)蛋白具有抗炎性[4]、抗癌性[5]、抗氧化性[6]、免疫熒光性[7]等生物活性。對(duì)藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白進(jìn)行有效利用會(huì)大大減少藍(lán)藻帶來的危害,還能進(jìn)一步做到資源化利用。國內(nèi)外專家研究藻藍(lán)蛋白的提取和純化方法表明,一般采用鹽析[8]、雙水相[9]、柱層析[10-11]等技術(shù)。通過相關(guān)技術(shù)得到的高純度藻藍(lán)蛋白在一定領(lǐng)域中用途廣泛。目前,很多研究探討了藻藍(lán)蛋白的提取與純化方法,而對(duì)于相關(guān)方法制備得到的藻藍(lán)蛋白分析較少。響應(yīng)面方法分析藻藍(lán)蛋白純度與回收率,可以從多維度、廣角度、深層次綜合利用水華藍(lán)藻對(duì)人類醫(yī)療美容事業(yè)以及將純度高的藻藍(lán)蛋白用于生物技術(shù)與環(huán)保事業(yè)提供了一定的思路和參考。

本文以羥基磷灰石為金屬螯合親和色譜填料,通過柱色譜分離純化藻藍(lán)蛋白,在考察洗脫液pH、離子強(qiáng)度、洗脫速度3個(gè)單因素對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和回收率影響的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和回收率進(jìn)行分析,促進(jìn)藻藍(lán)蛋白提取純化更廣闊的開發(fā)和利用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

巢湖藍(lán)藻藻泥采集自位于合肥市濱湖區(qū)的巢湖西湖區(qū)水體,距水體表層0.15 m處。主要試劑為CHT-B型羥基磷灰石、硫酸銨(NH4)2SO4、磷酸二氫鈉NaH2PO4、磷酸氫二鈉Na2HPO4、氫氧化納NaOH 、氯化鈉NaCl 、鹽酸HCl。實(shí)驗(yàn)儀器為HJ-6恒溫磁力攪拌器(常州國華電器有限公司)、KDC-160HR低溫高速離心機(jī)(安徽中科中佳儀器公司)、DGT-G電熱恒溫干燥箱(合肥華德利科學(xué)器材有限公司)、QuickSep中高壓層析系統(tǒng)(北京慧德易科技有限責(zé)任公司)、Vantage-L層析柱(美國Millipore公司)、UV/VIS-1950紫外-可見分光光度儀(北京普析通用公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 藻藍(lán)蛋白粗提液的制備。將含水率為96.4%的巢湖藻泥自冷庫內(nèi)取出,于室溫下水浴解凍,如此反復(fù)凍融3次后,經(jīng)4層紗布過濾除去不溶物質(zhì)。所得上清液再于低溫高速(-4 ℃,8 000 r/min)條件下離心20 min除去變性蛋白,得到藻藍(lán)蛋白粗提液。

(2) 兩步分段鹽析。向藻藍(lán)蛋白粗提液中緩慢加入1.2 mol/L (NH4)2SO4,并用恒溫磁力攪拌器不斷攪拌直至全部溶解,靜置20 min后低溫高速離心,分離一步鹽析的上清液和沉淀,以達(dá)到去雜的目的。再向收集的上清液中追加 (NH4)2SO4至1.8 mol/L,攪拌直至全部溶解,靜置20 min后低溫高速離心,分離二步鹽析的上清液和沉淀,以達(dá)到沉淀分離純化的目的。

(3) 透析脫鹽。將分離的二步鹽析沉淀溶解于10 mmol/L的PBS中,轉(zhuǎn)移進(jìn)透析袋中并保證密封性,然后放入10 mmol/L的PBS透析液中,低溫透析24 h,期間更換透析液3次以上以保證脫鹽效果。

(4) 柱色譜分離純化。先將羥基磷灰石用堿液浸泡1 h后裝柱,柱型為1.6 cm×50 cm,柱床高22 cm。再用10 mmol/L、pH值為7的磷酸鹽緩沖液沖洗色譜柱柱床,使填料達(dá)到陰陽離子平衡。將脫鹽后的樣品上樣,先后以不同濃度梯度(0.02 mol/L PBS、0.10 mol/L PBS、0.20 mol/L PBS,另加0.1 mol/L NaCl)的洗脫液進(jìn)行階段洗脫,洗脫速度為5 mL/min,收集洗脫的組分,測(cè)量藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白的純度和濃度。

(5) 單因素實(shí)驗(yàn)。采用控制變量法,每組分別單獨(dú)改變洗脫液的pH、離子強(qiáng)度、洗脫速度,進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值,使用origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 分析方法

根據(jù)藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白的光譜學(xué)特性來表征藻藍(lán)蛋白的純度與濃度:藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白不僅各在620 nm與650 nm處有典型的特征吸收峰,而且與一般蛋白質(zhì)相同，在280 nm處也有相應(yīng)吸收峰[8,12]。

藻藍(lán)蛋白純度為:

P=A620/A280，

藻藍(lán)蛋白(phycocyanin,PC)質(zhì)量濃度為:

ρPC=(A620-0.7A650)/7.38，

藻藍(lán)蛋白的回收率為:

R=100ρPCVt/(ρPC0V0)。

別藻藍(lán)蛋白純度為

P=A650/A280，

別藻藍(lán)蛋白(apuophycocyanin,APC)質(zhì)量濃度為:

ρAPC=(A620-0.7A650)/7.38，

別藻藍(lán)蛋白的回收率為：

R=100ρAPCVt/ρAPC0V0。

其中:A280、A620、A650分別為280、620、650 nm波長(zhǎng)處的吸光度;Vt為柱色譜純化后藻藍(lán)蛋白或別藻藍(lán)蛋白溶液的體積；ρPC0、ρAPC0為藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白進(jìn)樣時(shí)的質(zhì)量濃度；V0為藻藍(lán)蛋白或別藻藍(lán)蛋白的進(jìn)樣體積。

純化的藻藍(lán)蛋白或別藻藍(lán)蛋白純度≥3.0可作為藥品級(jí),其回收率簡(jiǎn)稱為3.0回收率;純度≥4.0為試劑級(jí)藻藍(lán)蛋白或試劑級(jí)別藻藍(lán)蛋白,其回收率簡(jiǎn)稱為4.0回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 洗脫液pH值實(shí)驗(yàn)

pH對(duì)藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響如圖1所示。

圖1 pH對(duì)藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響

由圖1可知:藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白純度隨著pH值的增加,均先增大后減小,但藻藍(lán)蛋白在pH=6.5時(shí)達(dá)到最大為4.23,別藻藍(lán)蛋白在pH=7.0時(shí)達(dá)到最大為4.18;試劑級(jí)藻藍(lán)蛋白回收率(CPC 4.0回收率)和試劑級(jí)別藻藍(lán)蛋白回收率(APC4.0回收率)隨著pH值的增加均先增大后減少,但藻藍(lán)蛋白在pH值 6.5時(shí)達(dá)到最大為28.59%,別藻藍(lán)蛋白在pH=7.0時(shí)達(dá)到最大為6.35%,這是因?yàn)樵逅{(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白的等電點(diǎn)和氨基酸組成略有差異,所以變化趨勢(shì)略有不同。由于藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白的組氨酸咪唑基、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸巰基等與鈣離子間可形成穩(wěn)定的螯合物[13],而洗脫液pH值影響兩者與鈣離子螯合反應(yīng)的平衡常數(shù)和自身酸堿性,從而決定吸附劑對(duì)兩者吸附效果。

本文實(shí)驗(yàn)以提純?cè)噭┘?jí)藻藍(lán)蛋白為最終目的,故選擇藻藍(lán)蛋白純化結(jié)果為判斷依據(jù),結(jié)果表明在pH=6.5時(shí),藻藍(lán)蛋白為堿性蛋白質(zhì),與雜蛋白和鈣離子螯合時(shí)具有相對(duì)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),此時(shí)純度與回收率最高,故最適pH值應(yīng)為6.5。

2.1.2 離子強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)

離子強(qiáng)度對(duì)藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響如圖2所示。

圖2 離子強(qiáng)度對(duì)藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響

由圖2可知:藻藍(lán)蛋白純度和試劑級(jí)回收率隨著磷酸鹽離子強(qiáng)度的增加而先增大后減小,在0.08 mol/L時(shí)均達(dá)到最大,分別為4.32%和32.80%;別藻藍(lán)蛋白純度和回收率隨著離子強(qiáng)度的增加雖略有波動(dòng)但總體相差不大,這是由于改變的洗脫液磷酸鹽離子強(qiáng)度的階段對(duì)應(yīng)著藻藍(lán)蛋白的洗脫階段,別藻藍(lán)蛋白洗脫階段雖略受影響但總體較穩(wěn)定。由于離子強(qiáng)度大小影響磷酸鹽離子對(duì)藻藍(lán)蛋白等堿性蛋白質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)作用,從而決定填料對(duì)藻藍(lán)蛋白等堿性蛋白的吸附容量。結(jié)果表明離子強(qiáng)度為0.08 mol/L時(shí),藻藍(lán)蛋白、雜蛋白與填料的螯合作用在此時(shí)會(huì)相差較大,因而能夠相對(duì)較多地解吸洗脫下來,故最適離子強(qiáng)度應(yīng)為0.08 mol/L。

2.1.3 洗脫速度實(shí)驗(yàn)

洗脫速度對(duì)藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響如圖3所示。

圖3 洗脫速度對(duì)藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響

由圖3可知:藻藍(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白純度和回收率均隨著離子強(qiáng)度的增加而先增大后減小,且在洗脫速度為3 mL/min時(shí)達(dá)到最大值,分別為 4.39%、35.94%和4.41%、8.16%;醫(yī)藥級(jí)藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白回收率隨著洗脫速度的增加先呈波動(dòng)狀態(tài),這是由于受洗脫效果影響,醫(yī)藥級(jí)回收率可能與試劑級(jí)回收率同步增長(zhǎng),也可能由于總回收率的限制,會(huì)與試劑級(jí)回收率呈現(xiàn)出反向增長(zhǎng)。洗脫速度會(huì)影響色譜柱的柱效,過快會(huì)降低分離效果和容量,因?yàn)轵戏磻?yīng)往往需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間才能達(dá)到平衡[14]。結(jié)果表明洗脫速度為3 mL/min時(shí),色譜柱柱效與分離速度適當(dāng),洗脫峰不會(huì)過寬或過尖,純度與回收率最高,分離效果較好,故最適洗脫速度應(yīng)為3 mL/min。

2.2 羥基磷灰石柱色譜法響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上,通過單因素方差分析,以洗脫液pH值、離子強(qiáng)度、洗脫速度為影響因素,以藻藍(lán)蛋白純度和回收率為響應(yīng)變量,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表1所列。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表

純度為響應(yīng)變量的響應(yīng)面圖如圖4～圖6所示。

圖5 pH與洗脫速度交互作用

圖6 離子強(qiáng)度與洗脫速度

由圖4可知,每個(gè)響應(yīng)面圖均有明顯的峰值,最佳工藝參數(shù)在各因素的取值范圍內(nèi),表明本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有效。圖4中pH值與離子強(qiáng)度的響應(yīng)面坡度較陡峭,在XY平面上的等高線密集,顏色變化快,隨著pH值與離子強(qiáng)度的變化,回收率的響應(yīng)面亦發(fā)生變化,這說明pH值與離子強(qiáng)度之間并不是獨(dú)立作用,而是存在一定的交互作用,彼此相互制約,相互影響。這可能是由于柱色譜的填料羥基磷灰石對(duì)藻藍(lán)蛋白的吸附與洗脫效果會(huì)受到洗脫液的pH值與離子強(qiáng)度雙重影響,造成純化后藻藍(lán)蛋白的回收率會(huì)受到洗脫液pH值與離子強(qiáng)度的交互作用影響[15]。

圖5中XY平面上的等高線稀疏且呈規(guī)則的圓形,而響應(yīng)面曲面坡度只在其中一個(gè)影響因素變化時(shí)坡度比較陡峭,在另一個(gè)影響因素變化時(shí)坡度平緩,說明2個(gè)因素之間不存在顯著的交互作用,表明此時(shí)pH值與洗脫速度不發(fā)生顯著的交互作用。

圖6中離子強(qiáng)度與洗脫速度的響應(yīng)面坡度較陡峭,在XY平面上的等高線密集,顏色變化快,隨著離子強(qiáng)度與洗脫速度的變化,回收率的響應(yīng)面變化迅速而明顯,對(duì)應(yīng)的等高線圖有一定程度的橢圓化,這說明離子強(qiáng)度與洗脫速度之間并不是獨(dú)立作用,而是存在一定的交互作用,彼此相互制約,相互影響。這可能是由于柱色譜的填料羥基磷灰石對(duì)藻藍(lán)蛋白的吸附容量和分離效果會(huì)受到洗脫液的離子強(qiáng)度與洗脫速度雙重影響,造成純化后藻藍(lán)蛋白的回收率會(huì)受到洗脫液離子強(qiáng)度與洗脫速度的交互作用影響。

由以上分析可知,響應(yīng)面曲面圖與等高線圖所反映的各影響因素間的交互作用及顯著性與方差分析中的結(jié)論保持一致。

以回收率為響應(yīng)變量的響應(yīng)面圖與以純度為響應(yīng)變量的響應(yīng)面圖具有趨同性,回收率變化規(guī)律與純度相近,因此回收率響應(yīng)面圖以純度響應(yīng)面圖為例。

通過數(shù)學(xué)分析確定了藻藍(lán)蛋白的最佳模擬工藝參數(shù)為洗脫液pH值為6.32、離子強(qiáng)度為0.08 mol/L、洗脫速度為3.56 mL/min,在此條件下,藻藍(lán)蛋白純度與回收率的理論最佳值為4.52%和38.36%。為了驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,在上述最佳模擬工藝參數(shù)的條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)取平均值,藻藍(lán)蛋白純度與回收率的均值為4.51%與38.38%。實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值比較接近,模型擬合度高[16]。因此,通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)羥基磷灰石純化藻藍(lán)蛋白進(jìn)行優(yōu)化是可行的,且由于考慮到各影響因素的交互作用,與單因素實(shí)驗(yàn)相比,更接近實(shí)際情況。

2.3 機(jī)理分析

2.3.1 藻藍(lán)蛋白的紫外-可見光譜特征分析

實(shí)驗(yàn)流程中各工藝階段中藻藍(lán)蛋白樣品的紫外-可見吸收光譜圖如圖7所示。由圖7可知,一步鹽析工藝與粗提液的峰形基本相同,但強(qiáng)度略低,這表明一步鹽析工藝會(huì)去除部分雜蛋白及少量藻藍(lán)蛋白,藻藍(lán)蛋白的純度略有上升。二步鹽析工藝會(huì)伴隨有紅移現(xiàn)象:蛋白質(zhì)吸收峰由264 nm紅移至276 nm處;藻藍(lán)蛋白副吸收峰由332 nm紅移至360 nm處。這表明二步鹽析將藻藍(lán)蛋白從溶液中沉淀,在此過程中去除了大量核酸,因此會(huì)出現(xiàn)上述紅移現(xiàn)象[17]。蛋白質(zhì)吸收峰強(qiáng)度下降,藻藍(lán)蛋白典型吸收峰(620 nm處)強(qiáng)度上升,雜蛋白也被大量去除,藻藍(lán)蛋白的純度顯著上升。經(jīng)過柱色譜工藝后,蛋白質(zhì)吸收峰強(qiáng)度進(jìn)一步下降,藻藍(lán)蛋白典型吸收峰與副吸收峰強(qiáng)度顯著上升,同時(shí)峰形由對(duì)稱變?yōu)榉菍?duì)稱,這表明已經(jīng)進(jìn)一步去除大量雜蛋白,從而藻藍(lán)蛋白的純度達(dá)到了試劑級(jí)。

圖7 各工藝紫外可見吸收光譜圖

2.3.2 試劑級(jí)藻藍(lán)蛋白熒光光譜圖

經(jīng)羥基磷灰石純化藻藍(lán)蛋白后得到的試劑級(jí)樣品的熒光光譜圖如圖8所示。

圖8 試劑級(jí)藻藍(lán)蛋白熒光光譜圖

由圖8可知，對(duì)試劑級(jí)藻藍(lán)蛋白溶液進(jìn)行熒光光譜掃描,激發(fā)光波長(zhǎng)范圍為580～640 nm,獲得熒光激發(fā)光譜,最大熒光激發(fā)峰位于632.4 nm。用固定波長(zhǎng)620 nm光照射,獲得熒光發(fā)射光譜,最大熒光發(fā)射峰為643.6 nm。從發(fā)射峰峰形和強(qiáng)度來看約于638 nm處呈現(xiàn)鏡像對(duì)稱。由藻藍(lán)蛋白的屬性可知,藻藍(lán)蛋白分子于純化過程中并未變性,仍然保持著生物活性。經(jīng)此工藝純化的試劑級(jí)藻藍(lán)蛋白分子具有完整的化學(xué)結(jié)構(gòu)(包括高級(jí)結(jié)構(gòu))以及相應(yīng)的生物學(xué)功能,說明了所選擇工藝適合于純化藻藍(lán)蛋白。

2.3.3 藻藍(lán)蛋白的紅外光譜特征分析

實(shí)驗(yàn)工藝流程中各工藝階段中藻藍(lán)蛋白樣品的紅外吸收光譜圖如圖9所示。由圖9可知,1 658 cm-1處為νC=O的吸收峰,1 537 cm-1處為反式酰胺構(gòu)型中NH的吸收峰,1 400 cm-1處為順式酰胺構(gòu)型中NH的吸收峰[18]。這表明粗提液中蛋白質(zhì)具有α-螺旋和β-折疊2種結(jié)構(gòu)。因?yàn)橐徊禁}析工藝加入大量硫酸銨,所以νNH導(dǎo)致3 421 cm-1峰頻率向低頻方向移動(dòng),1 400 cm-1峰強(qiáng)度大幅度增加,表明NH4+對(duì)樣品紅外吸收的干擾;同時(shí)出現(xiàn)νS=O的吸收峰(1 112 cm-1)和νSO的吸收峰(617 cm-1),對(duì)應(yīng)SO42-對(duì)樣品紅外吸收的干擾[19];硫酸銨的大量加入會(huì)擾亂蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。二步鹽析工藝后,藻藍(lán)蛋白溶液中硫酸銨濃度下降。經(jīng)過柱色譜工藝后,已充分脫鹽;從C=O 基團(tuán)所在峰的位置、形狀(1 658 cm-1處)表明藻藍(lán)蛋白主要以締合體形式存在,1 537 cm-1處的吸收峰表明藻藍(lán)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。

圖9 各工藝紅外吸收光譜圖

3 結(jié) 論

(1) 羥基磷灰石柱色譜法純化藻藍(lán)蛋白單因素實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件分別為pH 值6.5、離子強(qiáng)度0.08 mol/L、洗脫速度3 mL/min。此時(shí)藻藍(lán)蛋白純度最高可達(dá)4.42,試劑級(jí)藻藍(lán)蛋白回收率最高為36.93%。

(2) 對(duì)羥基磷灰石柱色譜法純化藻藍(lán)蛋白響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用二次回歸方程模擬,并進(jìn)行方差分析與顯著性檢驗(yàn),模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合度良好。P值、等高線與響應(yīng)曲面等表明,pH值與離子強(qiáng)度之間、離子強(qiáng)度與洗脫速度之間具有顯著的交互作用,而pH值與洗脫速度之間不具有顯著的交互作用,洗脫速度為低速時(shí)柱色譜的吸附-解吸效果更穩(wěn)定,改變離子強(qiáng)度洗脫時(shí)與其他影響因素交互作用顯著。

(3) 根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)二次回歸方程模擬的結(jié)果,最佳工藝參數(shù)為洗脫液pH值6.32、離子強(qiáng)度0.08 mol/L、洗脫速度3.56 mL/min。在此條件下,藻藍(lán)蛋白純度與回收率的理論最佳值為4.52%和38.36%,實(shí)驗(yàn)3次均值為4.51%與38.38%,純化效果優(yōu)于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

(4) 通過對(duì)藻藍(lán)蛋白進(jìn)行紫外-可見光譜、熒光光譜和紅外光譜分析,表明本文所選工藝適合提純?cè)噭┘?jí)藻藍(lán)蛋白。