張?zhí)鹛?，?瑤，呂文亮，林顯華，徐海燕，谷 巍

(山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司/山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271017)

畜牧養(yǎng)殖行業(yè)主要依賴(lài)抗生素來(lái)防治動(dòng)物疾病，而抗生素的大量使用卻引發(fā)了獸藥殘留、超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)等問(wèn)題[1]。隨著人們對(duì)動(dòng)物食品品質(zhì)要求的提高、監(jiān)管部門(mén)對(duì)獸藥殘留的嚴(yán)格控制，市場(chǎng)對(duì)安全、高效、低毒獸藥的需求越來(lái)越高，微生態(tài)制劑的研究為開(kāi)發(fā)綠色、安全、有效的抗生素替代產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。乳桿菌屬和雙歧桿菌屬及其他腸道微生物組中占優(yōu)勢(shì)的益生菌，已被證明可通過(guò)免疫刺激、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、抑制病原菌和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來(lái)改變腸道微生物群落并降低動(dòng)物疾病風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。植物乳桿菌是益生菌中的主要候選菌株，因?yàn)樗鼈兙哂锌苟喾N病原體的抗菌活性、對(duì)膽汁和低酸堿度的耐受性以及對(duì)腸細(xì)胞的黏附性[4-6]。REN等[7]的研究結(jié)果表明，植物乳桿菌可促進(jìn)幼稚T細(xì)胞分化(Th1)并參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，具有預(yù)防和控制食源性疾病的潛力；SERVIN等[8]、HAMILTON-MILLER[9]的研究結(jié)果均表明，植物乳桿菌對(duì)沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、假單胞菌和螺桿菌等具有良好的拮抗作用；TARRAH等[10]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌LSC3可有效地黏附在黏蛋白和腸細(xì)胞上。

針對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌病，目前的益生菌產(chǎn)品以復(fù)合微生態(tài)制劑為主。李瑞香等[11]使用乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等組成的復(fù)合微生態(tài)制劑預(yù)防雛雞雞白痢沙門(mén)氏菌病，雛雞成活率可提高30%，其中的乳酸桿菌需要與多種其他菌種復(fù)配才能達(dá)到一定的防治效果。蔡榮等[12]使用地衣芽孢桿菌、發(fā)酵乳桿菌、黏性?xún)?yōu)桿菌、雙叉雙歧桿菌等組成的復(fù)合微生態(tài)制劑，可有效防治雞白痢沙門(mén)氏菌病。益生菌的生物學(xué)特性研究是微生態(tài)制劑研制的重要基礎(chǔ)性工作。為儲(chǔ)備抗沙門(mén)氏菌病的候選菌株，從自貯存的益生菌中篩選具有良好雞白痢沙門(mén)氏菌拮抗能力的乳酸菌，并評(píng)價(jià)其生長(zhǎng)性能、酸堿耐受性、消化酶耐受性、腸道黏膜黏附能力、安全性、傳代穩(wěn)定性等益生性能，以期為益生菌株的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試培養(yǎng)基及緩沖液

MRS培養(yǎng)基[13]、LB培養(yǎng)基[14]、PBS緩沖液[15]、糞便培養(yǎng)基[16]均參照對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)中方法配制。

1.2 供試菌株

乳酸菌BLCC2-0410、BLCC2-0154、BLCC2-0155、BLCC2-0107、BLCC2-0001、BLCC2-0112、BLCC2-0111、BLCC2-0092、BLCC2-0038，雞白痢沙門(mén)氏菌BLCC8-0017、BLCC8-0098，均由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司生物工程研究院菌種資源保藏中心提供。

雞白痢沙門(mén)氏菌CVCC537、CVCC533購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 供試糞便

樣品取自泰安鳳臺(tái)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.4 抑菌試驗(yàn)

采用牛津杯法[17]測(cè)定各益生菌株發(fā)酵液(均培養(yǎng)16 h)對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌的體外抑菌效果。

1.5 植物乳桿菌BLCC2-0410與雞白痢沙門(mén)氏菌的共培養(yǎng)試驗(yàn)

1.5.1 菌液的制備 將植物乳桿菌BLCC2-0410接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件培養(yǎng)18 h，4 000 r/min離心5 min，獲得的菌體用PBS重懸，并調(diào)整菌液OD600值為0.1，備用。

接種雞白痢沙門(mén)氏菌CVCC533于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩器120 r/min培養(yǎng)18 h，4 000 r/min離心5 min，獲得的菌體用PBS重懸，并調(diào)整菌液OD600值為0.1，備用。

1.5.2 共培養(yǎng) 將植物乳桿菌BLCC2-0410菌懸液與雞白痢沙門(mén)氏菌菌懸液等體積混合，按1%(V/V)接種至半固體糞便培養(yǎng)基中，作為共培養(yǎng)組(RS組)；植物乳桿菌BLCC2-0410菌懸液與PBS等體積混合，以1%(V/V)接種至半固體糞便培養(yǎng)基中，作為植物乳桿菌BLCC2-0410培養(yǎng)組(R組)；雞白痢沙門(mén)氏菌菌懸液與PBS等體積混合，以1%(V/V)接種至半固體糞便培養(yǎng)基中，作為雞白痢沙門(mén)氏菌培養(yǎng)組(S組)。各組置于37 ℃搖床中120 r/min培養(yǎng)，于24 h進(jìn)行雞白痢沙門(mén)氏菌和植物乳桿菌BLCC2-0410的計(jì)數(shù)。

1.6 植物乳桿菌BLCC2-0410菌株的生物學(xué)特性測(cè)定

1.6.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 將活化的菌液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，于不同的培養(yǎng)時(shí)間取樣測(cè)定pH值以及活菌數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.6.2 耐酸性試驗(yàn) 將活化的菌液分別接種于pH值為2.5和3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，以pH值6.0的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)4 h，取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

存活率=(待測(cè)pH值的菌液活菌數(shù)/初始菌液活菌數(shù))×100%。

1.6.3 膽鹽耐受性試驗(yàn) 將活化的菌液分別接種于含0.1%、0.2%、0.3%禽膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，以不加禽膽鹽的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)4 h，取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。

存活率=(待測(cè)膽鹽含量的菌液活菌數(shù)/初始菌液活菌數(shù))×100%。

1.6.4 消化酶耐受性試驗(yàn) (1)人工消化液的制備：參照《中國(guó)藥典》中人工胃液及人工腸液方法制備[18]。(2)益生菌菌液制備：取植物乳桿菌BLCC2-0410過(guò)夜培養(yǎng)液，離心收集菌體，使用無(wú)菌生理鹽水復(fù)溶，稀釋10倍備用。(3)消化酶耐受性試驗(yàn)：將制備的菌液1 mL與9 mL胃蛋白酶液混合，37 ℃靜置培養(yǎng)，于0、2、4 h分別計(jì)數(shù)。將制備的菌液1 mL與9 mL胰蛋白酶液混合，37 ℃靜置培養(yǎng)，于0、4 h分別計(jì)數(shù)。

1.6.5 腸道黏附試驗(yàn) 取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加0.5 mL黏液，4 ℃過(guò)夜固定后，每孔加0.5 mL無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，然后每孔加0.5 mL標(biāo)記菌懸液。另以未加黏液的0.5 mL標(biāo)記菌懸液作陽(yáng)性對(duì)照，28 ℃孵育2 h。除陽(yáng)性對(duì)照外，再用0.5 mL無(wú)菌生理鹽水洗去未黏附的細(xì)菌。

收集吸出的懸液和每次的洗滌液，采用梯度稀釋法進(jìn)行菌體計(jì)數(shù)，計(jì)算出未黏附的總菌量，最后計(jì)算出該菌黏附的百分比。黏附率=1-(未黏附菌量/陽(yáng)性對(duì)照)×100%。

1.6.6 植物乳桿菌BLCC2-0410安全性試驗(yàn) 引入健康海蘭褐雛雞，自0日齡開(kāi)始，采用經(jīng)口灌喂法給予受試菌液及生理鹽水，灌喂量為0.5 mL/只，每天2次(早、晚各1次)，灌喂至10日齡。每天稱(chēng)量體質(zhì)量。其中對(duì)照組雛雞灌喂滅菌生理鹽水，試驗(yàn)組雛雞灌喂植物乳桿菌BLCC2-0410菌液，低劑量組和高劑量組分別灌喂活菌量為1.0×1010cfu/mL、1.0×1011cfu/mL的菌液。試驗(yàn)期間雛雞自由采食，飼喂環(huán)境相同。觀察雛雞精神狀態(tài)，記錄雛雞體質(zhì)量及進(jìn)食量、死亡情況，剖檢觀察肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等臟器病變情況。

1.6.7 植物乳桿菌BLCC2-0410傳代穩(wěn)定性測(cè)定 將植物乳桿菌BLCC2-0410接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h作為第1代菌液，以1%(V/V)比例接種于另一MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h作為第2代菌液，如此連續(xù)接種傳至第25代。對(duì)5代、15代、25代細(xì)菌培養(yǎng)物測(cè)試抑制CVCC533的性能，同時(shí)進(jìn)行菌液計(jì)數(shù)并測(cè)定其pH值，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩試驗(yàn)結(jié)果

從表1可以看出，植物乳桿菌BLCC2-0410對(duì)4株雞白痢沙門(mén)氏菌均有抑制效果，且抑制效果最好，對(duì)CVCC537、CVCC533、BLCC8-0098的抑菌圈直徑均在15 mm以上，對(duì)BLCC8-0017的抑菌圈直徑也在11 mm以上，其他菌株對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌抑菌圈較小，甚至無(wú)抑菌圈。由此可見(jiàn)，在9株乳酸菌中，植物乳桿菌BLCC2-0410對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌抑制效果最好。

表1 益生菌株對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌的抑菌圈直徑

2.2 植物乳桿菌BLCC2-0410與雞白痢沙門(mén)氏菌的共培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，植物乳桿菌BLCC2-0410與雞白痢沙門(mén)氏菌共培養(yǎng)24 h，雞白痢沙門(mén)氏菌數(shù)量降低了約3個(gè)對(duì)數(shù)值；共培養(yǎng)對(duì)植物乳桿菌BLCC2-0410的生長(zhǎng)影響較小，與植物乳桿菌BLCC2-0410培養(yǎng)組相比，活菌數(shù)僅低0.4個(gè)對(duì)數(shù)值。

圖1 共培養(yǎng)條件下雞白痢沙門(mén)氏菌(A)和植物乳桿菌BLCC2-0410(B)的生長(zhǎng)性能

2.3 植物乳桿菌BLCC2-0410的生物學(xué)特性

2.3.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 如圖2所示，植物乳桿菌BLCC2-0410接種后2 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8 h即進(jìn)入穩(wěn)定期，11～12 h達(dá)到最高活菌數(shù)4.7×109cfu/mL，24 h后進(jìn)入衰亡期。菌液發(fā)酵至16 h達(dá)最低pH值，為3.74。可見(jiàn)，植物乳桿菌BLCC2-0410生長(zhǎng)性能良好，產(chǎn)酸性能強(qiáng)。

2.3.2 耐酸性試驗(yàn)結(jié)果 從表2可以看出，植物乳桿菌BLCC2-0410在pH值2.5和3.0的酸性環(huán)境培養(yǎng)4 h，存活率分別為33.1%、88.9%，說(shuō)明該菌可耐受pH值2.5和3.0的酸性環(huán)境。

2.3.3 膽鹽耐受性試驗(yàn)結(jié)果 從表3可以看出，植物乳桿菌BLCC2-0410在0.1%禽膽鹽環(huán)境中培養(yǎng)4 h，存活率為97%。隨著禽膽鹽含量的增加，存活率下降，在0.2%、0.3%禽膽鹽環(huán)境中培養(yǎng)4 h，存活率分別為31%和4%，但活菌數(shù)仍在1.0×106cfu/mL以上。由此可以看出，植物乳桿菌BLCC2-0410對(duì)0.1%～0.3%的膽鹽環(huán)境具有一定的耐受能力。

圖2 植物乳桿菌BLCC2-0410的生長(zhǎng)曲線(xiàn)及pH值變化曲線(xiàn)

表2 植物乳桿菌BLCC2-0410耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

表3 植物乳桿菌BLCC2-0410禽膽鹽耐受性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 消化酶耐受性試驗(yàn)結(jié)果 從表4可以看出，在胃蛋白酶液中處理2 h，植物乳桿菌BLCC2-0410存活率為78.6%，處理4 h存活率為34.3%；在胰蛋白酶液中處理4 h，植物乳桿菌BLCC2-0410存活率為77.8%。由此可知，植物乳桿菌BLCC2-0410對(duì)胰蛋白酶及胃蛋白酶均有較強(qiáng)的耐受性。

2.3.5 腸道黏附試驗(yàn)結(jié)果 植物乳桿菌BLCC2-0410對(duì)腸黏膜具有一定的黏附能力。陽(yáng)性對(duì)照組菌液活菌數(shù)為3.3×108cfu/mL，未黏附的菌量為2.7×108cfu/mL。由此可知，植物乳桿菌BLCC2-0410對(duì)腸黏膜的黏附率為18.2%。

表4 植物乳桿菌BLCC2-0410消化酶耐受性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.6 植物乳桿菌BLCC2-0410安全性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)期間，高劑量組、低劑量組及對(duì)照組雛雞精神狀態(tài)良好，糞便形態(tài)無(wú)明顯差異，各組雛雞體質(zhì)量及進(jìn)食量無(wú)明顯差異(圖3、圖4)，剖檢觀察肝臟、脾臟、肺臟、腎臟均無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。綜上說(shuō)明，在試驗(yàn)活菌含量范圍內(nèi)，植物乳桿菌BLCC2-0410對(duì)雛雞是安全的。

圖3 植物乳桿菌BLCC2-0410對(duì)雛雞體質(zhì)量的影響

圖4 植物乳桿菌BLCC2-0410對(duì)雛雞進(jìn)食量的影響

2.3.7 植物乳桿菌BLCC2-0410傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 如圖5所示，植物乳桿菌BLCC2-0410連續(xù)傳5代、15代、25代細(xì)菌形態(tài)均為短桿菌，菌體大小均勻、形態(tài)單一。

圖5 植物乳桿菌BLCC2-0410各代次的菌體形態(tài)

從表5可以看出，各代次菌液活菌含量、發(fā)酵液pH值以及對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌的抑菌圈直徑均差別不大。說(shuō)明植物乳桿菌BLCC2-0410傳代穩(wěn)定性良好。

表5 植物乳桿菌BLCC2-0410的傳代穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

乳酸菌可以通過(guò)產(chǎn)生H2O2、抗菌素、有機(jī)酸等各種代謝產(chǎn)物來(lái)抑制致病菌的生長(zhǎng)[19-23]。ZHANG等[1]的研究結(jié)果表明，乳酸菌可在體外有效抑制大腸桿菌和白痢沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，BLCC2-0410對(duì)3株雞白痢沙門(mén)氏菌的抑菌圈直徑在15 mm以上，對(duì)另外1株沙門(mén)氏菌抑菌圈直徑介于11～15 mm，與其他乳酸菌株相比，體外抑菌效果最好，且與雞白痢沙門(mén)氏菌共培養(yǎng)可有效降低沙門(mén)氏菌的數(shù)量。大量研究表明，菌株生長(zhǎng)得越快，越容易獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[24-27]。本研究結(jié)果顯示，植物乳桿菌BLCC2-0410在37 ℃培養(yǎng)2 h即進(jìn)入菌株生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，最高活菌數(shù)可達(dá)4.7×109cfu/mL，生長(zhǎng)速度快，生長(zhǎng)性能良好。植物乳桿菌BLCC2-0410發(fā)酵液最低pH值為3.74，顯著低于靳勝男等[17]篩選出的乳酸菌發(fā)酵液pH值4.21，表明植物乳桿菌BLCC2-0410產(chǎn)酸性能相對(duì)良好。

益生菌能否通過(guò)胃腸道并發(fā)揮其益生作用，與其對(duì)胃腸環(huán)境的耐受性密切相關(guān)[28]。這些環(huán)境包括消化道中的酶、pH值和膽鹽等?，F(xiàn)有資料顯示，禽類(lèi)的胃內(nèi)pH值為2.5～5.1[25]。植物乳桿菌BLCC2-0410在胃蛋白酶液中處理2 h，存活率78.6%，在pH值2.5和3.0時(shí)的存活率為33.1%、88.9%。本研究結(jié)果與郝露露等[29]的研究結(jié)果相似，菌株32E、B14、C24在pH值3.0的人工模擬胃液中處理3 h內(nèi)存活率為80%以上。因此認(rèn)為，植物乳桿菌BLCC2-0410能耐受雞胃環(huán)境中的酸和消化酶的環(huán)境。消化道中的膽汁可以防止病原菌黏附到腸黏膜頂部并避免細(xì)胞損傷[30]，同時(shí)，也對(duì)乳酸菌的存活產(chǎn)生威脅。資料顯示，禽腸道中的膽鹽含量為0.03%～0.3%[31]。本研究中，菌株在胰蛋白酶液中處理4 h，植物乳桿菌BLCC2-0410存活率77.8%；隨著禽膽鹽含量的增大，存活率下降，在禽膽鹽含量0.3%時(shí)，存活率為4%，但活菌數(shù)仍可在106cfu/mL以上。BEGLEY等[32]和LAHTEINEN等[33]的研究結(jié)果表明，乳酸菌若在腸道內(nèi)發(fā)揮益生作用，其攝入腸道內(nèi)的活菌含量需達(dá)到106～107cfu/mL?？梢?jiàn)，植物乳桿菌BLCC2-0410能耐受雞腸道中的膽鹽及消化酶的環(huán)境。

乳酸菌對(duì)腸道的黏附有助于增強(qiáng)乳酸菌和腸細(xì)胞之間的信號(hào)交換，進(jìn)而促進(jìn)其在腸中的定植，并競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原體的定殖、提高機(jī)體免疫力[34]。因此，乳酸菌的黏附性是評(píng)估其用作益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)，已有資料證明乳酸桿菌具有與細(xì)菌病原體類(lèi)似的表面黏附素[35]。一些表面定位的分子如脂磷壁酸、凝集素樣分子和蛋白質(zhì)，被鑒定為與宿主細(xì)胞表面上的特定受體相互作用的黏附素[8,36]。本研究中，植物乳桿菌BLCC2-0410對(duì)腸道具有一定的黏附能力，黏附率為18.2%。與郝露露等[29]的研究相比，黏附率略低，可能與菌株活菌含量、生長(zhǎng)階段、表層蛋白等因素有關(guān)[37]。

安全與否是菌株能否應(yīng)用的基礎(chǔ)，菌株安全性一般是通過(guò)體內(nèi)或體外的方式考察，如魯旭等[38]通過(guò)有毒代謝產(chǎn)物的測(cè)定及小鼠口服灌喂方式研究了糞腸球菌的安全性；蔡熙姮等[39]通過(guò)腹腔注射小鼠的方式證明藍(lán)狐源嗜酸乳桿菌菌株是安全的。本研究使用本體動(dòng)物雞，以最高1.0×1011cfu/mL的活菌含量，采取口服灌喂的方式進(jìn)行了動(dòng)物安全性試驗(yàn)，結(jié)果表明，高、低劑量灌喂均未引起雞只的死亡，各組雛雞體質(zhì)量及進(jìn)食量與對(duì)照組無(wú)差異，剖檢觀察雛雞肝臟、脾臟、肺臟、腎臟均無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。綜上，植物乳桿菌BLCC2-0410對(duì)雛雞無(wú)明顯致病性，可作為禽用益生菌開(kāi)發(fā)的儲(chǔ)備資源。

遺傳物質(zhì)在復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)差錯(cuò)的頻率為百萬(wàn)分之一，絕大多數(shù)的突變對(duì)菌株生命活動(dòng)影響不大，但在發(fā)酵過(guò)程中，菌種的連續(xù)傳代可能會(huì)導(dǎo)致菌株負(fù)變個(gè)體的不斷積累，達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，造成菌種生產(chǎn)性狀、培養(yǎng)特性等的變化，退化現(xiàn)象會(huì)逐漸顯現(xiàn)[40]。本研究中，植物乳桿菌BLCC2-0410傳代5代、15代、25代的發(fā)酵性能、產(chǎn)酸能力、抑菌性能均無(wú)較大差異，說(shuō)明植物乳桿菌BLCC2-0410傳代25代以?xún)?nèi)穩(wěn)定性良好。為保證菌株質(zhì)量，可控制菌株傳代次數(shù)在15代以?xún)?nèi)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。

綜上，本研究篩選了1株對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌具有良好抑制作用的植物乳桿菌，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，有很大的開(kāi)發(fā)潛力，有望在動(dòng)物疾病防控中發(fā)揮重要作用。