王若宇，伍玉南，唐 丹

細(xì)胞核增殖抗原Ki67是反映細(xì)胞增殖的核抗原，是目前應(yīng)用最廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)記之一。臨床上，檢測(cè)腫瘤組織Ki67可反映腫瘤細(xì)胞增殖水平，預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后[1,2]。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，在腫瘤組織和正常組織其水平存在差異[3]。研究表明，非小細(xì)胞肺癌患者癌組織miRNA-26b水平與癌旁組織或良性病變的正常組織相比均顯著下調(diào)，以此診斷非小細(xì)胞肺癌的敏感性和特異性分別為79.9%和79.4%。miRNA-26b表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素[4]。本研究采用RT-qPCR法檢測(cè)了HCC患者血漿Ki67和miRNA-26b水平，分析了不同臨床和病理學(xué)特征患者這兩種指標(biāo)的差異，或?yàn)榕R床診斷HCC患者提供新手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年12月～2018年12月我院診治的HCC患者90例，男57例，女33例；年齡28～71歲，平均年齡為(50.1±11.7)歲。診斷符合《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診斷指南(2015年版)》[5]。另選擇乙型肝炎肝硬化患者60例，男36例，女24例；年齡25～74歲，平均年齡為(48.2±12.0)歲，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》的標(biāo)準(zhǔn)[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)入院時(shí)肝功能存在嚴(yán)重障礙；2)合并其他惡性腫瘤；3)接受放化療及其他輔助治療。本研究通過(guò)了我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者簽署了知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent、miRNA-26b、U6引物(均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，Ki67和β-actin上下游引物(北京六合華大基因科技股份有限公司)，SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)，無(wú)核酸酶水(DEPC處理水，Sigma)。

1.3 血漿miRNA-26b和Ki67水平檢測(cè) 抽取外周靜脈血6 mL，置于EDTA抗凝管，1 h內(nèi)在4℃條件下用低速離心機(jī)2500 r/m離心10 min。取血漿600μL，分裝于2 mL無(wú)RNA酶的EP管中，置于-80℃凍存。在血漿中加入TRIZOL 1 mL，混勻后冰上靜置5 min；加入氯仿200 μL，充分震蕩，冰上靜置5 min，4℃，12000 r/m離心15 min。輕取上層液體，加入異丙醇500 μL，冰上靜置10 min，12000 r/m離心10 min，棄去上清液，留RNA沉淀，加入75%乙醇1 mL，充分混勻，7500 r/m離心5 min，棄去上清液，干燥5 min，加入DEPC 15 μL，溶解RNA。在260 nm和280 nm處檢測(cè)吸光度值。當(dāng)吸光度值>1.8且<2.0時(shí)，用于檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量qPCR檢測(cè)：將提取得到的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。檢測(cè)miRNA-26b時(shí)以U6作為內(nèi)參，采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)如下：Ki67上游：5'-ACGAGACGCCTGGTTACTATCA-3'，下游5'-CTGTTTTGCTGCATTCTGTGC-3'；β-actin上游：5'-TCGTGCGTGACATTAAGG-3'，下游5'-AGGAAGGA-AGGCTGGAAG-3’；miRNA-26b上游：5'-GAAGATCTATGGCCCATCTGAGGTTG-3'，下游5'-CCCAAGCTTAAAAACCTGGA-CCACGAAT-3'；U6上游：5'-CTTCGGCAGCACATATACT-3'，下游5'-AAAATATGCAACGCTTCACG-3’。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。Ki67和miRNA-26b RNA相對(duì)水平按公式(2-△△Ct法)計(jì)算。根據(jù)ROC曲線(xiàn)結(jié)果，確定Ki67和miRNA-26b mRNA水平的臨界值。ROC曲線(xiàn)上兩個(gè)指標(biāo)串聯(lián)試驗(yàn)是依次進(jìn)行幾項(xiàng)檢驗(yàn)項(xiàng)目，先做特異性高的實(shí)驗(yàn)A，A為陽(yáng)性者再做B。只有試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)才判斷為陽(yáng)性，否則為陰性；并聯(lián)試驗(yàn)是同時(shí)做幾種檢驗(yàn)項(xiàng)目，其中一項(xiàng)為陽(yáng)性即判斷為陽(yáng)性。檢測(cè)水平高于臨界值時(shí)，為高水平，反之則為低水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料呈非正態(tài)分布，故以【M(Q1,Q3)】表示，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；繪制ROC曲線(xiàn)，分析血漿Ki67和miRNA-26b診斷HCC的價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿Ki67和miRNA-26b水平比較 HCC患者血漿Ki67水平為【1.6(1.1～2.2)】，顯著高于肝硬化組【0.4(0.1～1.2)，P<0.05】；HCC患者血漿miRNA-26b水平為【0.7(0.3～1.4)】，顯著低于肝硬化組【2.0(1.4～3.0)，P<0.05】。

2.2 不同臨床和病理學(xué)特征患者血漿Ki67水平分布比較 將不同腫瘤直徑、Edmonson分級(jí)、早期復(fù)發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行單因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同腫瘤Edmonson分級(jí)、早期是否復(fù)發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移患者血漿Ki67水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3 不同臨床和病理學(xué)特征患者血漿 miRNA-26b水平分布比較 不同Edmonson分級(jí)、早期是否腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移患者血漿miRNA-26b水平存在顯著性差異(P<0.05，表2)。

2.4 血漿Ki67和miRNA-26b水平診斷HCC的效能分析 血漿Ki67診斷HCC的ROC曲線(xiàn)下面積為0.8(95%置信區(qū)間為0.7～0.9)。血漿miRNA-26b診斷HCC的ROC曲線(xiàn)下面積為0.8(95%置信區(qū)間為0.8～0.9)。兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)串聯(lián)試驗(yàn)可提高診斷HCC的特異度，并聯(lián)試驗(yàn)可提高診斷的靈敏性(表3)。

表1 不同臨床和病理學(xué)特征患者血漿Ki67水平分布(%)比較

表2 不同臨床和病理學(xué)特征患者血漿 miRNA-26b水平分布(%)比較

表3 血漿Ki67和miRNA-26b診斷HCC的效能

3 討論

HCC 位居世界第五大常見(jiàn)腫瘤。由于HCC 發(fā)病隱匿，病情進(jìn)展迅速，當(dāng)患者確診時(shí)大多已經(jīng)處于疾病的中、晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)時(shí)機(jī)，即使行腫瘤切除術(shù)后也很容易復(fù)發(fā)[7]。HCC篩查和早期診斷臨床意義重大。然而，目前處于研究階段的大量 HCC標(biāo)志物，診斷的準(zhǔn)確性并不優(yōu)于影像學(xué)方法或血清AFP，且絕大多數(shù)未進(jìn)入臨床應(yīng)用[8-11]。因此，尋找有效的診斷HCC生物標(biāo)志物是目前臨床診斷和治療HCC患者亟待解決的關(guān)鍵性問(wèn)題。

腫瘤學(xué)研究的一個(gè)重要問(wèn)題是預(yù)測(cè)腫瘤的進(jìn)展和患者的生存率。傳統(tǒng)上，腫瘤的類(lèi)型、分期和細(xì)胞有絲分裂活性是主要的預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)[10]。Ki67是一種非組蛋白核皮質(zhì)蛋白，參與聚合酶I依賴(lài)性核糖體RNA合成的早期步驟。Ki67水平在整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)都在變化，在有絲分裂期間達(dá)到峰值水平。雖然Ki67的功能尚未完全闡明，但有證據(jù)表明它在細(xì)胞分裂和核糖體RNA合成中起作用[12-14]。因此，Ki67的重要性越來(lái)越大，特別是在生長(zhǎng)緩慢的腫瘤，如胃腸道胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(GEP-NENS)[15-17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC患者血漿Ki67水平升高，而且在不同Edmonson分級(jí)、是否存在早期腫瘤復(fù)發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移的HCC患者血漿Ki67水平顯著不同。ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果表明，血漿Ki67水平診斷HCC的ROC曲線(xiàn)下面積為0.8，其相應(yīng)的診斷靈敏性和特異度分別為55.6%和95.0%，提示血漿Ki67水平是可以作為診斷HCC的一個(gè)新指標(biāo)。

近年來(lái)，miRNA的發(fā)現(xiàn)和深入研究為腫瘤靶向研究提供了新的思路，成為目前腫瘤靶向治療研究的最新熱點(diǎn)。采集患者外周血并檢測(cè)miRNAs，方法簡(jiǎn)單、方便，更容易被患者和臨床醫(yī)生所接受，且miRNA 具有非常強(qiáng)的穩(wěn)定性，常溫放置超過(guò) 24 h、反復(fù)凍融、強(qiáng)酸強(qiáng)堿等極端條件都不影響其穩(wěn)定性[18-20]。研究表明，miRNA作為癌基因或腫瘤抑制因子而發(fā)揮作用。作為腫瘤相關(guān)小RNA之一的miRNA-26b可能在功能上能調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，如在人食管癌、鼻咽癌、原發(fā)性鱗狀細(xì)胞肺癌和舌鱗狀細(xì)胞癌等。此外，一些研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)，在一些癌癥，如乳腺癌和胃癌，miRNA-26b水平下調(diào)，表明miRNA-26b是一種腫瘤抑制因子。miRNA-26b的過(guò)度表達(dá)可顯著抑制體外肺癌細(xì)胞或結(jié)腸癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，抑制腫瘤的生長(zhǎng)[19，20]。有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-26a可通過(guò)HGF-cMet信號(hào)抑制HCC組織血管生成，從而抑制 HCC的生長(zhǎng)和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，是肝癌新的治療靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC患者血漿miRNA-26b顯著低于乙型肝炎肝硬化患者。不同腫瘤Edmonson分級(jí)、是否存在早期腫瘤復(fù)發(fā)或腫瘤轉(zhuǎn)移的HCC患者血漿miRNA-26b水平顯著不同。ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果表明，血漿miRNA-26b水平診斷HCC的ROC曲線(xiàn)下面積為0.8，其相應(yīng)的診斷靈敏性和特異度分別為70.0%和83.3%。血漿Ki67和miRNA-26b聯(lián)合診斷的效能與血漿Ki67或miRNA-26b單獨(dú)指標(biāo)比，診斷效能顯著提高，可為HCC的診斷提供重要的參考信息。