郭 勇，張 雄，史開志，陳大軍，黃明捷，莫先艇，王天松，張 勇*

（1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550005；4.赫章九龍農(nóng)業(yè)旅游開發(fā)有限公司，貴州赫章 553200）

豬肉的口感受遺傳、營養(yǎng)、屠宰和加工工藝等多種因素影響，量化為肌肉pH、肉色、肌內(nèi)脂肪（Intramuscular Fat，IMF）、肌肉水分、嫩度、多汁性、風(fēng)味評(píng)分等指標(biāo)，其中IMF 含量的高低往往能影響人們對(duì)肉產(chǎn)品的選擇，國外品種經(jīng)過多年選育，其IMF含量仍不及多個(gè)國內(nèi)地方豬種[1]。研究表明，脂肪沉積包括脂肪的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解等過程，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliFerator-activated receptorγ，PPARγ）、脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein lipase，LPL）和乙酰輔酶A 羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）是參與合成脂肪的關(guān)鍵酶，脂肪甘油三酯脂酶（Adipose triglyceride lipase,ATGL）屬于脂解酶，均為對(duì)動(dòng)物脂肪沉積具有調(diào)控作用的重要基因[2-5]。豬脂肪細(xì)胞有前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞2 種類型，前體脂肪細(xì)胞由PPARγ等早期轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控分化為成熟脂肪細(xì)胞，脂肪的存在形式主要是甘油三酯，由脂肪酸被組織酯化合成，脂肪酸可由攝入體內(nèi)的葡萄糖在ACC 等酶的作用下所轉(zhuǎn)化，或是血液中乳糜微粒和極低密度脂蛋白所攜帶的甘油三酯被LPL 分解成甘油和脂肪酸[6-8]。ATGL是參與脂肪代謝的重要酶之一，其將脂肪組織中甘油三酯水解以調(diào)控細(xì)胞中脂肪酸與甘油的平衡[9]。

柯樂豬作為貴州省優(yōu)質(zhì)地方豬種，屬于烏金豬支系，具有中等偏大體型，較大且呈漏斗狀的腹部，具有抗病力和抗逆性較強(qiáng)的特點(diǎn)，能較好地適應(yīng)貴州喀斯特地區(qū)濕冷復(fù)雜的養(yǎng)殖環(huán)境[10]。野柯F1代豬已于2017年注冊(cè)為“夜郎黃金豬”商標(biāo)，以黃毛系柯樂豬為母本、野豬為父本，其雜交后毛色呈金黃色，肉品質(zhì)優(yōu)良，具有耐粗飼、耐牧、肉質(zhì)鮮香、低背膘厚等特點(diǎn)。本研究選用柯樂豬×野豬F1代雜交豬作為研究對(duì)象，通過測(cè)定其胴體及肉質(zhì)性狀指標(biāo)，并與脂肪沉積相關(guān)酶基因的表達(dá)水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為柯野雜交豬脂肪沉積效應(yīng)遺傳分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選取5 頭全同胞柯樂豬×野豬F1代，于赫章九龍農(nóng)業(yè)旅游開發(fā)有限公司夜郎黃金豬養(yǎng)殖場飼養(yǎng)至10 月齡。宰前禁食12 h，屠宰后取背最長肌和皮下脂肪組織樣品，凍存于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80℃冷凍保存。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol 購自（大連）寶生物公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo ScientiFic RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis）、熒光染料（2×RealStar Green Fast Mixture with ROX）購自貴州西寶生物公司；核酸染料、無酶水（RNase-Free water）、無水乙醇、異丙醇、DL2000 DNA marker 等均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。電子天平購自德國賽多利斯公司；游標(biāo)卡尺購自日本三豐（mitutoyo）公司；C-LM3B 型數(shù)顯嫩度儀購自北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司；CR-400 型色差儀購自日本柯尼卡美能達(dá)公司；Soxtec2055 型全自動(dòng)索氏抽提儀購自丹麥福斯公司；CFX96 實(shí)時(shí)定量PCR 儀購自Bio-Rad 公司。

1.3 測(cè)定指標(biāo) 各項(xiàng)胴體、肉質(zhì)性狀指標(biāo)參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《瘦肉型豬胴體性狀測(cè)定技術(shù)規(guī)范》（NY/T 825-2004）、《豬肌肉品質(zhì)測(cè)定技術(shù)規(guī)范》（NY/T 821-2004）進(jìn)行測(cè)定。

1.4 總RNA 的提取及cDNA 的逆轉(zhuǎn)錄 通過Trizol 法提取背最長肌和皮下脂肪組織RNA，并通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和OD 值。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將合成后的cDNA 置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank 上豬（Sus scroFa）PPARγ、LPL、ACC、ATGL、GAPDH基因序列，使用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，基因引物序列見表1。

表1 PPARγ、LPL、ACC、ATGL、GAPDH 基因序列

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng) 使用Bio-Rad 公司CFX96 實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行定量分析，以GAPDH 基因作為內(nèi)參，對(duì)單個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量體系采用20 μL：2×RealStar Green Fast Mixture with ROX 10 μL、正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL、cDNA模板1 μL、RNase-Free H2O 8 μL。反應(yīng)條件采用兩步法PCR 擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s、退火30 s、72℃延伸30 s 共35 個(gè)循環(huán)，72℃終延伸2 min。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用Excel 2016 軟件對(duì)各組織中目的基因和內(nèi)參基因mRNA 表達(dá)量進(jìn)行處理，運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算，結(jié)果以平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示；運(yùn)用SPSS 26.0軟件中Pearson 方法檢測(cè)背最長肌和皮下脂肪組織中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表達(dá)量與胴體肉質(zhì)性狀指標(biāo)間相關(guān)性；通過STRING 在線網(wǎng)站（https://string-db.org/）對(duì)各蛋白互作關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 胴體肉質(zhì)測(cè)定 由表2 可知，柯樂豬×野豬F1代肉質(zhì)指標(biāo)中，肌肉水分為71.67 %、肌內(nèi)脂肪為3.26%、皮厚為3.83 mm、背膘厚為39.30 mm、眼肌面積為37.12 cm2。

表2 柯樂豬×野豬F1代的胴體肉質(zhì)性狀

2.2 胴體肉質(zhì)性狀相關(guān)性分析 由表3 可知，柯樂豬×野豬F1代pH1h與L*、a*和b*呈現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.926；r=-0.941；r=-0.929，）；肌肉水分與肌內(nèi)脂肪間呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.911）；背膘厚與眼肌面積間呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.896）。

表3 胴體指標(biāo)、肉質(zhì)性狀之間的相關(guān)性

2.3 常規(guī)PCR 擴(kuò)增結(jié)果 利用普通PCR 方法進(jìn)行目的基因片段和內(nèi)參基因片段擴(kuò)增，并經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由圖1 可知，PPARγ、LPL、ACC、ATGL和GAPDH引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長度及目的片段與預(yù)期片段大小相符，電泳條帶清晰、無拖尾、拖帶現(xiàn)象，cDNA 和引物可用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.4 背最長肌和皮下脂肪組織中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表達(dá)水平 由圖2 可知，ACC基因在背最長肌中相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于ATGL基因，其次為LPL基因；在皮下脂肪中相對(duì)表達(dá)量最高的為PPARγ基因，其次為ACC基因，LPL基因表達(dá)最低。

圖2 背最長?。ˋ）和皮下脂肪組織（B）中PPARγ、LPL、ACC、ATGL 基因mRNA 表達(dá)水平

2.5 背最長肌組織中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表達(dá)量間相關(guān)性 由表4 可知，在背最長肌組織中4 個(gè)目的基因間兩兩均為正相關(guān)關(guān)系，其中，PPARγ與LPL基因mRNA 表達(dá)量呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)（r=0.890）；LPL 與ACC基因mRNA 表達(dá)量呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)（r=0.959）。

表4 背最長肌中PPARγ、LPL、ACC、ATGL 基因mRNA 表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)

2.6 皮下脂肪組織中PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因mRNA 表達(dá)量的相關(guān)性 由表5 可知，皮下脂肪組織中PPARγ與LPL基因呈負(fù)相關(guān)，與ACC、ATGL基因mRNA 表達(dá)量呈正相關(guān)，其中，與ACC基因間呈顯著正相關(guān)（r=0.887）。

表5 皮下脂肪中PPARγ、LPL、ACC、ATGL 基因mRNA 表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)

2.7 背最長肌和皮下脂肪組織中各基因mRNA 表達(dá)量與胴體肉質(zhì)性狀之間的相關(guān)性 由表6 可知，背最長肌組織中4 個(gè)基因mRNA 表達(dá)量均與肌內(nèi)脂肪、皮厚和背膘厚呈正相關(guān)，與滴水損失、熟肉率、剪切力、肌肉水分和眼肌面積呈負(fù)相關(guān)，其中PPARγ、LPL基因mRNA表達(dá)量均與肌肉水分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.940，r=-0.908，P＜0.05）；在皮下脂肪組織中LPL基因mRNA 表達(dá)量與皮厚間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.909，P＜0.05）。

2.8 蛋白互作關(guān)系 由圖3 可知，LPL 蛋白與ATGL（PNPLA2）蛋白間存在蛋白互作，而ATGL 蛋白、PPARγ蛋白和ACC 蛋白兩兩間均存在著蛋白互作關(guān)系。同時(shí)，LPL基因和PPARγ基因參與了PPAR 信號(hào)通路（PPAR Signaling Pathway），PPARγ與ACC基因參與了AMPK 信號(hào)通路（Adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase Signaling Pathway）。

圖3 PPARγ、LPL、ACC、ATGL 蛋白間互作關(guān)系

3 討 論

雜交改良是豬育種重要的實(shí)驗(yàn)方法之一，利用不同親本組合雜交得到的后代可產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)，以此獲得優(yōu)良的生產(chǎn)性狀[11]。相同屠宰體重階段，柯樂豬× 野豬F1代背膘厚低于純種柯樂豬（42.4 mm），眼肌面積高于純種柯樂豬（23.97 cm2），表明地方豬與野豬雜交可有效地降低地方豬皮下脂肪的沉積速率，提高豬瘦肉產(chǎn)量[10]。

研究表明，PPARγ、LPL基因在豬中的mRNA 表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈不同程度的正相關(guān)[12-13]，ACC基因和ATGL基因均已在豬中發(fā)現(xiàn)，且在脂肪沉積過程中均發(fā)揮著不同的作用[14-15]。通過預(yù)測(cè)各蛋白互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LPL 蛋白與ATGL（PNPLA2）蛋白間存在蛋白互作，且ATGL 蛋白、PPARγ蛋白和ACC 蛋白兩兩間均存在著蛋白互作關(guān)系。同時(shí)，LPL基因和PPARγ基因參與了PPAR 信號(hào)通路，PPARγ與ACC基因參與了AMPK信號(hào)通路。PPAR 信號(hào)通路主要通過PPARs 與配體結(jié)合，激活與視黃醇類X 受體（RXR）的異二聚化，然后與靶基因中的特定DNA 反應(yīng)元件（PPAREs）結(jié)合，轉(zhuǎn)換來自代謝環(huán)境的適當(dāng)信號(hào)來控制基因表達(dá)，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、代謝穩(wěn)態(tài)和脂肪形成等作用[16]；MAPK 信號(hào)通路主要包含經(jīng)典MAPK 信號(hào)通路、JNK/p38MAPK信號(hào)通路和ERK5 信號(hào)通路，其參與了多種細(xì)胞及生長因子活化后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長和分化的作用[17]。本研究中，PPARγ、LPL、ACC、ATGL基因在背最長肌和皮下脂肪組織中均有不同程度表達(dá)，背最長肌中相對(duì)表達(dá)量最高的為ACC基因，顯著高于ATGL基因，其次為LPL基因；在皮下脂肪中相對(duì)表達(dá)量最高的為PPARγ基因，其次為ACC基因，LPL基因表達(dá)最低。在背最長肌中LPL與PPARγ、ACC基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，皮下脂肪組織中PPARγ與ACC基因間呈顯著正相關(guān)。

表6 背最長肌和皮下脂肪組織中各基因mRNA 表達(dá)量和胴體肉質(zhì)性狀之間的相關(guān)性

本研究中肌內(nèi)脂肪與肌肉水分呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.911），這與在從江香豬中的研究結(jié)果相同[13]，同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)肌肉水分和LPL及PPARγ基因表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)。肌肉水分直接影響肉色和嫩度等肉質(zhì)性狀，也關(guān)系到肉產(chǎn)品的存儲(chǔ)時(shí)長[18]。前人研究發(fā)現(xiàn)，LPL基因在大圍山微型雞腿肌中的表達(dá)顯著高于胸肌，而腿肌和胸肌中的肌肉水分含量卻剛好相反[19]；在昭烏達(dá)羊背最長肌中，PPARγ基因的表達(dá)量低于烏拉特羊，但昭烏達(dá)羔羊肉的肌肉水分含量高于烏拉特羊[20]。這與本研究中LPL和PPARγ基因表達(dá)量與肌內(nèi)水分間呈顯著負(fù)相關(guān)的結(jié)果相同。對(duì)16 周齡九龍鵝中ATGL基因mRNA的表達(dá)與機(jī)體脂肪沉積之間的相關(guān)性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ATGL基因mRNA 的表達(dá)量與皮下脂肪率呈顯著正相關(guān)，而與腹部脂肪率、胸肌率、腿肌率、腿肌肌內(nèi)脂肪率和胸肌肌內(nèi)脂肪率呈不同程度負(fù)相關(guān)，表明ATGL基因?qū)琵堸Z在機(jī)體脂肪沉積過程中具有一定的調(diào)控作用[21]。姚焰礎(chǔ)[22]研究發(fā)現(xiàn)蘇尼特羔羊肌內(nèi)脂肪含量與ACC基因和LPL基因的mRNA 表達(dá)量呈極顯著或顯著正相關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)在背最長肌中豬脂肪沉積相關(guān)酶基因的表達(dá)均與肌內(nèi)脂肪間呈正相關(guān)的結(jié)果類似。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，LPL基因與皮厚呈負(fù)相關(guān)。LPL的基因表達(dá)是脂肪細(xì)胞分化的早期標(biāo)志之一，限制著血漿甘油三酯的清除率和脂肪酸的組織攝取率[23]。在牛前體脂肪細(xì)胞中，過表達(dá)或沉默miR-224 時(shí)，C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、FASN和PLIN1相對(duì)表達(dá)量隨之降低或上升，而miR-224 靶向LPL基因并存在負(fù)調(diào)控關(guān)系，表明LPL基因?qū)εＧ绑w脂肪細(xì)胞的成脂分化具有調(diào)控作用[24]。同時(shí)在貴州從江香豬LPL基因的內(nèi)含子4 中存在AFa I 酶切變異位點(diǎn)與皮厚性狀指標(biāo)顯著相關(guān)[25]，這與本研究中LPL基因與皮厚呈負(fù)相關(guān)類似，暗示了LPL基因可作為豬脂肪沉積相關(guān)重要候選基因。計(jì)劃下一步將采用細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染等技術(shù)對(duì)脂肪沉積相關(guān)酶基因從細(xì)胞水平進(jìn)行研究，進(jìn)一步了解其在豬脂肪沉積過程中的調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)背最長肌組織中PPARγ、LPL基因表達(dá)量均與肌肉水分呈顯著負(fù)相關(guān)；在皮下脂肪組織中LPL基因表達(dá)量與皮厚間呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果可進(jìn)一步印證LPL基因在柯樂豬×野豬F1代脂肪沉積過程中發(fā)揮著重要作用。