蔡 馨， 陳娟娟， 湯冬玲， 張平安

武漢大學(xué)人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 武漢 430060

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，侵襲性和轉(zhuǎn)移性較高，目前為我國(guó)第4位常見(jiàn)惡性腫瘤，致死率位居第2位[1]。由于HCC在早期階段缺乏有效生物標(biāo)志物，患者一經(jīng)確診通常為中晚期。因此，研究調(diào)控HCC的侵襲遷移機(jī)制和尋找早期HCC生物標(biāo)志物，對(duì)于HCC的早期診斷、治療和預(yù)后判斷具有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是單鏈RNA中的一個(gè)亞種，為內(nèi)源性非編碼RNA，擁有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不具有3′端poly(A)和5′端帽子。circRNA因其環(huán)狀結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定、癌癥組織豐度高及組織相對(duì)特異等特點(diǎn)，參與慢性肝病惡性轉(zhuǎn)化，其表達(dá)改變有望成為HCC早期診斷與預(yù)后評(píng)估的新標(biāo)志物或有效治療的新靶點(diǎn)。本文將綜述近幾年circRNA在HCC中的研究進(jìn)展。

1 circRNA的形成及分類

circRNA于1976年在RNA病毒中首次被發(fā)現(xiàn)，1979年Hsu等通過(guò)電鏡在Hela細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了3′端和5′端共價(jià)相連組成的環(huán)狀分子[2]。因其特殊結(jié)構(gòu)，常被當(dāng)成異常的剪切副產(chǎn)物而被忽略。直到1993年才在人體中證實(shí)了這種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的閉合環(huán)狀非編碼RNA的存在。近年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)基因測(cè)序技術(shù)和生物物理學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，借助高通量測(cè)序技術(shù)，circRNA的生物學(xué)功能及其在人類疾病發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸被深入認(rèn)識(shí)。

circRNA主要是通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ處理蛋白編碼基因所形成[3]。同時(shí)circRNA生物合成是由RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)，內(nèi)含子對(duì)驅(qū)動(dòng)和套索驅(qū)動(dòng)，因此在調(diào)節(jié)相鄰剪接位點(diǎn)、促進(jìn)環(huán)狀生物合成方面具有重要作用。獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其相較于線性RNA具有更高的豐度、穩(wěn)定性以及保守性。

根據(jù)拼接的組成成分不同，circRNA可分為三類。(1)外顯子circRNA(exonic circRNA，E-circRNA)：是由后向剪切的外顯子組成。(2)內(nèi)含子circRNA (intron circRNA，ciRNA)：僅由內(nèi)含子組成。(3)外顯子-內(nèi)含子circRNA(exon-intron circRNA，EIciRNA)：同時(shí)包含外顯子和內(nèi)含子[4]。Jeck等[5]提出了兩種不同的外顯子環(huán)化模式，分別為lariat驅(qū)動(dòng)的環(huán)化模式和內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化模式。

2 circRNA生物學(xué)功能

2.1 circRNA作為microRNA(miRNA)海綿的功能 miRNA通過(guò)直接結(jié)合mRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)，circRNA有多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，能發(fā)揮海綿樣吸收miRNA作用，通過(guò)miRNA反應(yīng)元件競(jìng)爭(zhēng)性與miRNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平減少結(jié)合mRNA的miRNA數(shù)量來(lái)調(diào)控miRNA下游靶基因表達(dá)。譬如circHIPK3可以通過(guò)結(jié)合多種miRNAs包括腫瘤抑制基因miR-124，從而對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用[6]。circ-ITCH則可以通過(guò)circ-ITCH/miR-224-5p軸來(lái)調(diào)控MafF起到抗腫瘤作用[7]。

2.2 circRNA作為轉(zhuǎn)錄翻譯的調(diào)控元件 circRNA具有調(diào)控基因表達(dá)的功能，EIciRNAs包含親代基因的內(nèi)含子序列，能與轉(zhuǎn)錄機(jī)制相互影響。目前以circRNA為載體的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未研究清楚，推測(cè)circRNA可能是通過(guò)捕捉翻譯起始位點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)mRNA的翻譯和蛋白表達(dá)。

O’Gorman等[8]證明TFIIH特異性結(jié)合U1 snRNA，從而在早期的mRNA加工和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起到有效調(diào)控的作用。Li等[9]也證明了EIciEIF3J和EIciPAIP2這兩種在HEK-293中表達(dá)最豐富的EIciRNA在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)富集，因而推斷其可能促進(jìn)了親代mRNA的轉(zhuǎn)錄。這些研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄起始與mRNA拼接之間存在某種聯(lián)系，進(jìn)而揭示了一種新型的基于circRNA協(xié)同作用的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。

2.3 circRNA翻譯成為蛋白質(zhì)與多肽的能力 大部分circRNA包含外顯子，與核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)結(jié)合后能在體內(nèi)外進(jìn)行翻譯。目前已有一些circRNA被證實(shí)是由IRES介導(dǎo)翻譯[10]，如circFBXW7、circMBl、circZNF609等。除了經(jīng)典翻譯模式和上述IRES介導(dǎo)的翻譯模式之外，N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)殘基能富集于circRNA上啟動(dòng)翻譯。

3 circRNA的檢測(cè)分析

目前可以通過(guò)多種方法來(lái)分析circRNA，如circRNA的長(zhǎng)度、序列、亞細(xì)胞定位、與各種疾病之間的關(guān)系、分子間的相互作用、生物功能等。

3.1 利用circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)

3.1.1 circRNA信息整合數(shù)據(jù)庫(kù) 含有circBase、CIRCpedia、CircView、AtCircDB四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。主要收錄部分動(dòng)植物包括人類的circRNA信息。

3.1.2 circRNA功能數(shù)據(jù)庫(kù) circRNA除了最顯著的分子海綿功能，還有基因表達(dá)調(diào)控功能、翻譯功能等重要生物學(xué)功能。該數(shù)據(jù)庫(kù)概括了部分circRNA的生物學(xué)功能，如deepBase2.0、CircInteractome、CircNet、circRNADb、PlantcircBase、PlantCircNet、TSCD與CSCD、circlncRNAnet。以上數(shù)據(jù)庫(kù)各自針對(duì)性地收集了不同種類的circRNA功能特點(diǎn)以及分析結(jié)果。

3.1.3 與人類疾病相關(guān)的circRNA數(shù)據(jù)庫(kù) 該數(shù)據(jù)庫(kù)與臨床研究密切相關(guān)，在腫瘤標(biāo)志物的研究或癌癥的預(yù)后判斷中都起到了重要作用，包括Circ2Traits、exoRBase、circRNA disease、CircR2Disease四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)[11]。

3.2 circRNA測(cè)序技術(shù) RNA測(cè)序技術(shù)作為基因組學(xué)的重要分析手段，已經(jīng)驗(yàn)證了大量circRNA。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄的方法對(duì)RNA進(jìn)行分析，結(jié)合數(shù)字化信號(hào)測(cè)定技術(shù)，能直接了解所測(cè)circRNA的序列以及結(jié)構(gòu)等信息。

3.3 circRNA基因芯片 基因芯片是集高通量與高靈敏度于一身的現(xiàn)存較成熟且廣泛應(yīng)用的測(cè)序技術(shù)，通過(guò)將特定的有差異的探針固定于芯片上，并予以一些化學(xué)或生物標(biāo)記，當(dāng)待測(cè)circRNA與其結(jié)合后即可快速準(zhǔn)確地得到其序列信息。通過(guò)基因芯片可以檢測(cè)出circPABPN1、circEPSTI1和circMTO1等circRNA。

3.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR 該項(xiàng)技術(shù)可以分析機(jī)體在不同情況下體內(nèi)circRNA豐度的變化，也可以進(jìn)行序列分析從而得到待測(cè)circRNA連接處的序列甚至全長(zhǎng)序列。由于circRNA類型和表達(dá)與多因素相關(guān)，如存在細(xì)胞中的不同部位，故導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄PCR無(wú)法對(duì)circRNA進(jìn)行高通量分析[12]。

4 circRNA與HCC

4.1 circRNA與HCC的發(fā)生機(jī)制 circRNA與HCC發(fā)生密切相關(guān)，通過(guò)生物信息學(xué)分析建立了circRNA-miRNA-mRNA軸上的lncRNA-mRNA共表達(dá)和ceRNA(競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA)網(wǎng)絡(luò)。circRNA發(fā)揮分子海綿作用間接調(diào)控靶基因的表達(dá)。

目前通過(guò)軟件篩選出部分共表達(dá)的circRNA、miRNA、mRNA，構(gòu)建了表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。主要涉及肝臟細(xì)胞的分化、周期調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)調(diào)控等功能。進(jìn)一步分析表明，這些共表達(dá)的circRNA主要富集在10個(gè)通道當(dāng)中，如p53信號(hào)通道以及PI3K-Akt信號(hào)通道等，且有研究[13]發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)通道與HCC密切相關(guān)。

miRNA已經(jīng)被證實(shí)廣泛參與肝臟腫瘤的發(fā)展過(guò)程，其調(diào)控HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制涉及龐大且復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)，其中肝癌circRNA充當(dāng)miRNA的分子海綿，競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miRNA，導(dǎo)致目標(biāo)基因的抑制，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。研究[14]表明，hsa_circ_0005986在HCC組織中明顯下調(diào)，與乙型肝炎的家族史、腫瘤直徑、血管侵犯以及巴塞羅那分期密切相關(guān)。hsa_circ_0005986通過(guò)對(duì)miR-129-5p的分子海綿作用來(lái)調(diào)節(jié)NOTCH1 mRNA的表達(dá)。hsa_circ_0005075則通過(guò)參與肝癌細(xì)胞中的細(xì)胞黏附作用[15]，以及hsa_circ_0000711被證明在HepG2和SMMC-7721中表達(dá)上調(diào)，均為通過(guò)間接調(diào)控肝癌細(xì)胞的周期來(lái)影響肝癌細(xì)胞的擴(kuò)增[16]。hsa_circ_0004018在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，推測(cè)是通過(guò)分子海綿作用與miRNA結(jié)合來(lái)間接影響HCC的發(fā)展[17]。

4.2 circRNA與HCC的診斷和預(yù)后 通過(guò)GO通路分析，發(fā)現(xiàn)一些潛在的HCC患者特異性表達(dá)circRNA?？砷g接地對(duì)患者進(jìn)行肝癌的篩查，有利于早期診斷。通過(guò)分析受試者工作特征曲線(ROC曲線)得到circ_104075的ROC曲線下面積(AUC)為0.973，敏感度為0.960，特異度為0.983，相比于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，其對(duì)HCC診斷具有更高的敏感度和特異度[18]。hsa_circ_0128298也可能作為潛在的生物標(biāo)志物，其敏感度為0.716，特異度為0.815，AUC為0.668[19]。has_circ_0016788對(duì)HCC診斷價(jià)值較高，AUC為0.851[20]。cSMARCA5與一些經(jīng)典的生物標(biāo)志物聯(lián)合使用可以提高HCC的診斷率，并且在肝硬化以及乙型肝炎患者中表達(dá)下調(diào)[21]。hsa_circ_0001649通過(guò)作為miR-127-5p、miR-612和miR-4688的分子海綿來(lái)激活SHPRH基因，在癌組織中表達(dá)下調(diào)并且與腫瘤分期有關(guān)，其AUC為0.63，敏感度為0.81，特異度為0.69，有望成為新的診斷標(biāo)志物[22]。circADAMTS14則通過(guò)調(diào)控miR-572/RCAN1來(lái)抑制HCC的發(fā)展[23]，由于hsa_circ_0078602在癌組織中明顯下調(diào)，有望成為診斷標(biāo)志物。circ FLI1E2-4作為診斷HCC的生物標(biāo)志物，AUC為0.91[24]。

研究[25]發(fā)現(xiàn)circMTO1的表達(dá)下調(diào)與HCC患者的預(yù)后不良具有相關(guān)性，由此推測(cè)circMTO1對(duì)于HCC患者的預(yù)后具有判斷作用，而且利用探針技術(shù)確定circMTO1在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)結(jié)合miR-9發(fā)揮作用。

表1 與HCC相關(guān)的circRNA

隨著新一代基因測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的circRNA在HCC中被發(fā)現(xiàn)。不同circRNA在HCC中的表達(dá)水平不同(表1)，提示可選擇多種circRNA共同作為HCC的潛在生物標(biāo)志物，用于HCC的早期篩查和預(yù)后。

4.3 circRNA與HCC的治療 HCC患者血漿外泌體和肝組織來(lái)源circ-0051443，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-331-3p上調(diào)BAK1表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，達(dá)到抑制癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。同時(shí)體內(nèi)研究[39]也證實(shí)circ-0051443對(duì)BAK1的調(diào)控作用，能對(duì)裸鼠HCC移植瘤生長(zhǎng)起抑制作用。目前，已有抗癌藥物如氯化兩面針堿[40]將hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049作為靶標(biāo)來(lái)治療HCC。不同的治療藥物會(huì)有不同的靶circRNA，這種靶向分子近年來(lái)已被廣泛研究，并且期待在眾多circRNA中發(fā)現(xiàn)HCC有效治療的分子靶目標(biāo)。

4.4 circRNA與HCC干細(xì)胞 circRNA、腫瘤干細(xì)胞與癌癥緊密相關(guān)，近期發(fā)現(xiàn)HCC干細(xì)胞的再生與circ-MALAT1密切聯(lián)系，在RNA結(jié)合蛋白AUF1的介導(dǎo)下，circ-MALAT1在臨床HCC腫瘤干細(xì)胞樣本中高表達(dá)。circ-MALAT1在核糖體上阻止PAX5 mRNA翻譯，并且與核糖體以mRNA形成一個(gè)三聚體來(lái)促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞自我更新。這種阻止機(jī)制被稱為“circRNA剎車”，成為circRNA分子海綿功能外的另一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制[41]。

4.5 circRNA與免疫耐受 circMET在HCC組織中高表達(dá)，并且通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)換來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。circMET作為miR-30-5p家族的分子海綿調(diào)節(jié)miR-30-5p/snail/DPP4軸，從而改變了腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤免疫耐受，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[42]。

5 展望

circRNA已成為目前研究熱點(diǎn)，運(yùn)用不同實(shí)驗(yàn)技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法發(fā)掘了circRNA的部分生物學(xué)功能以及與HCC之間的關(guān)系。通過(guò)錨定這些特定的靶circRNA，就能進(jìn)一步通過(guò)其作用機(jī)理運(yùn)用藥物靶向分子治療或早期診斷HCC。對(duì)于HCC的相關(guān)circRNA還有待進(jìn)一步的研究探索，以期能夠在早期與傳統(tǒng)生物診斷指標(biāo)聯(lián)合使用，對(duì)HCC進(jìn)行臨床輔助篩查，從而間接提高HCC患者的生存率，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療。相信隨著越來(lái)越多與HCC相關(guān)、結(jié)構(gòu)多樣的circRNA被發(fā)現(xiàn)，對(duì)HCC復(fù)雜分子調(diào)控機(jī)制的闡明以及基于circRNA的HCC診斷與治療應(yīng)用等具有廣闊的前景。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：蔡馨負(fù)責(zé)資料分析，撰寫(xiě)論文；陳娟娟、湯冬玲參與文獻(xiàn)搜集，修改論文；張平安負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。