田 臻， 王麗莎， 姚耐娟， 趙英仁， 阮驪韜

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 a.感染科， b.超聲影像科， c.婦產(chǎn)科， 西安 710061

肝衰竭是病毒性、酒精性、藥物性以及缺血再灌注等多種因素引起的嚴(yán)重肝損傷。隨著人工肝、肝移植等治療手段的普及，肝衰竭患者的病死率顯著降低，但仍不低于40%[1]。在我國(guó)，繼發(fā)于慢性肝病的慢加急性肝衰竭(ACLF)約占肝衰竭患者總數(shù)的80%，肝衰竭特別是ACLF是威脅國(guó)人健康的重要疾病負(fù)擔(dān)[2]。

肝衰竭是由炎癥介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷過(guò)程，過(guò)度的炎癥反應(yīng)是肝衰竭發(fā)病過(guò)程的中心環(huán)節(jié)，抑制肝臟炎癥反應(yīng)能夠阻止肝衰竭的進(jìn)程[3]。在肝衰竭的發(fā)病過(guò)程中，由于腸道通透性的增加，患者經(jīng)常表現(xiàn)為內(nèi)毒素血癥，即血液中內(nèi)毒素(LPS)水平升高[4]。肝星狀細(xì)胞(HSC)占肝內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的5%～8%，是肝臟中肝細(xì)胞以外數(shù)量最多的細(xì)胞。研究[5-6]表明在肝癌和自身免疫性肝病的發(fā)病過(guò)程中，HSC可分泌炎癥因子促進(jìn)疾病的進(jìn)展。關(guān)于HSC在肝衰竭過(guò)程中的作用目前只有少數(shù)幾篇報(bào)道，HSC在肝衰竭疾病進(jìn)程中的作用目前尚不完全清楚。作者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSC在肝衰竭的發(fā)病過(guò)程中扮演著重要的角色：(1)在肝衰竭過(guò)程中HSC活化并分泌細(xì)胞外基質(zhì)維持肝臟結(jié)構(gòu)，避免肝臟塌陷從而發(fā)揮保護(hù)作用，肝衰竭過(guò)程中多種細(xì)胞因子抑制HSC活化促進(jìn)肝衰竭[7]；(2)LPS通過(guò)激活NLRP3炎癥小體誘發(fā)HSC炎癥反應(yīng)參與肝衰竭的發(fā)病過(guò)程[8]。然而，HSC炎癥參與肝衰竭疾病進(jìn)程的具體機(jī)制目前尚不完全清楚。

研究[9]認(rèn)為炎癥和氧化應(yīng)激共同參與肝衰竭，肝內(nèi)炎癥反應(yīng)可直接誘發(fā)肝細(xì)胞損傷，損傷的肝細(xì)胞增強(qiáng)肝內(nèi)氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)肝細(xì)胞的死亡并抑制肝細(xì)胞再生，形成惡性循環(huán)?；钚匝?ROS)參與多種炎癥細(xì)胞的炎癥反應(yīng)過(guò)程，損傷線粒體產(chǎn)生ROS激活NLRP3炎癥小體，引發(fā)炎癥反應(yīng)，這一機(jī)制可能也參與了肝衰竭的發(fā)病過(guò)程。最近的研究顯示，Reg3α凝集素抑制ROS進(jìn)而減輕LPS+D-GalN所誘發(fā)的小鼠急性肝衰竭的過(guò)程[10]。本實(shí)驗(yàn)旨在從氧化應(yīng)激的角度探究HSC炎癥反應(yīng)在ACLF發(fā)病過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性昆明種小鼠45只，6周齡，體質(zhì)量(20±2) g，清潔級(jí)，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(陜)2018-001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK(陜)2018-001。人血白蛋白購(gòu)于瑞士杰特貝林生物制品有限公司，LPS、D-GalN及N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，Annexin V-PI凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，兔抗小鼠Caspase 3、Caspase 8及β-Actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，IL-1β及IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D SYSTERM公司，相關(guān)生化指標(biāo)檢驗(yàn)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和NAC組，每組15只。模型組和NAC組小鼠人血白蛋白致敏后，尾靜脈注射人血白蛋白15 μg/g，每周2次，共12周；之后皮下注射人血白蛋白15 μg/g，每周1次，共4周，構(gòu)建小鼠慢性肝病模型；最后腹腔注射10 ng/g的LPS和800 μg/g的D-GalN誘導(dǎo)小鼠ACLF。NAC組小鼠ACLF造模前1周起每日按60 μg/g腹腔注射N(xiāo)AC，連續(xù)7 d，觀察小鼠一般狀況和病死率。小鼠死亡后立即摘除眼球取血，同時(shí)切取新鮮肝臟組織用4%中性甲醛固定，未死亡模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠LPS+D-GalN造模后48 h時(shí)處死；對(duì)照組注射等量生理鹽水，與另兩組小鼠同一時(shí)間處死，收取小鼠血液及肝組織備用。

1.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 轉(zhuǎn)氨酶(AST、ALT)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，按說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定小鼠血清AST、ALT，肝組織MDA、SOD含量。

1.4 肝組織病理學(xué) 肝組織置于4%多聚甲醛固定液中固定12 h，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、常規(guī)HE染色和光學(xué)樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察肝組織損傷情況。肝衰竭的病理表現(xiàn)為大片或亞大片肝細(xì)胞壞死，間質(zhì)組織塌陷，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。在本研究中，通過(guò)半定量病理指數(shù)評(píng)定肝臟組織病理改變：每個(gè)樣本測(cè)定10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中病變肝細(xì)胞數(shù)所占百分比，并換算成小數(shù)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝星狀細(xì)胞系LX2細(xì)胞和人肝細(xì)胞系HL7702細(xì)胞接種于含10%胎牛血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、50 ml/L CO2、95%濕度的孵育箱中傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在添加(不添加)10 mmol/L NAC的情況下用1 μg/ml LPS、400 μmol/L H2O2刺激LX2細(xì)胞4 h，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)基中IL-1β及IL-6。用1 μg/ml LPS、400 μmol/L H2O2刺激LX2細(xì)胞4 h，PBS洗滌LX2細(xì)胞3次后更換培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收取LX2培養(yǎng)基培養(yǎng)HL7702細(xì)胞12 h，Western Blot檢測(cè)HL7702細(xì)胞Caspase 8和Caspase 3表達(dá)，流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 用蛋白質(zhì)抽提劑按步驟提取HL7702細(xì)胞中總蛋白，Western Blot按常規(guī)步驟進(jìn)行，行SDS凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜50 min轉(zhuǎn)PVDF膜，加入兔抗小鼠Caspase 3和Caspase 8單克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜后應(yīng)用羊抗兔IgG第二抗體孵育1.5 h，ECL發(fā)光液孵育1 min后壓X光片，顯影、壓片。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HL7702細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化, 制成單細(xì)胞懸液, PBS漂洗, 重懸在1×結(jié)合緩沖液中, 調(diào)細(xì)胞密度為106個(gè)/ml, 用5 μl Annexin V-FITC和1×結(jié)合緩沖液室溫孵育15 min, 然后加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液和5 μl PI工作液, 置于冰上, 盡快對(duì)染色細(xì)胞于流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.8 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2018倫審科字第G-125號(hào)，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況 對(duì)照組15只小鼠全部存活；模型組15只小鼠D-GalN+LPS造模4 h后出現(xiàn)活動(dòng)明顯減少、豎毛、萎靡、拒食等現(xiàn)象，6 h后癥狀加劇并開(kāi)始出現(xiàn)昏迷、抽搐甚至死亡，至48 h時(shí)模型組共有小鼠12只死亡，存活率達(dá)20%(3/15)；NAC組小鼠ACLF表現(xiàn)較模型組輕，48 h時(shí)累積生存率為53.3%(8/15)。根據(jù)各組小鼠的存活情況繪制生存曲線，采用Kaplan-Meier法分析顯示，NAC治療組小鼠48 h累積生存率明顯優(yōu)于模型組(χ2=23.06，P<0.001)(圖1)。

圖1 各組小鼠的生存曲線

2.2 小鼠肝臟生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 與對(duì)照組及NAC組相比，模型組小鼠血清AST、ALT水平及肝組織MDA含量顯著升高，肝組織SOD水平顯著降低(P值均<0.01)(表1)。各組間血清LPS水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.200，P<0.01)，模型組及NAC組小鼠血清LPS水平較對(duì)照組均顯著升高(P值均<0.05)。各組間血清IL-1β水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.820，P<0.01)，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清IL-1β水平顯著升高(P<0.05)，NAC組血清IL-1β水平較模型組顯著降低(P<0.05)(圖2)。

圖2 各組小鼠血清LPS和IL-1β水平比較

表1 各組小鼠血清ALT、AST及肝組織MDA和SOD水平

2.3 小鼠肝組織病理改變 對(duì)照組小鼠:肝組織顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟，被膜光滑、完整，鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞沿中央靜脈放射排列；模型組小鼠:肝臟腫脹明顯，表面可見(jiàn)彌漫性出血點(diǎn)及散在瘀斑，質(zhì)地偏韌，光鏡下可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞變性壞死，同時(shí)可見(jiàn)壞死區(qū)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)并細(xì)胞間出血、淤血；NAC組小鼠：肝臟表面瘀斑及出血點(diǎn)分布較模型組輕，鏡下肝小葉破壞、肝細(xì)胞壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等狀況較模型組明顯減輕(圖3)。小鼠肝臟病理評(píng)分3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.250，P<0.01)，模型組小鼠肝臟病理評(píng)分明顯高于對(duì)照組和NAC組(P值均<0.05)(圖4)。

注:a,對(duì)照組；b,模型組;

圖4 各組小鼠肝臟病理評(píng)分

2.4 LPS誘導(dǎo)HSC炎癥反應(yīng) LPS及H2O2均可刺激LX2細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β和IL-6，特別發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗氧化劑NAC可有效抑制LPS或H2O2介導(dǎo)HSC炎癥反應(yīng)、減少炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌。對(duì)照組LX2細(xì)胞經(jīng)PBS作用后分泌極低水平的炎癥因子IL-1β和IL-6。各組間培養(yǎng)基IL-1β水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.740，P<0.01)，IL-6水平比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.800，P<0.01)(圖5)。

2.5 共培養(yǎng)條件下HSC誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡 經(jīng)PBS作用的對(duì)照組LX2細(xì)胞與正常組相比，其誘導(dǎo)HL7702細(xì)胞表達(dá)凋亡相關(guān)蛋白Caspase 8、Caspase 3及細(xì)胞凋亡、壞死水平均未見(jiàn)明顯并異。在LX2-HL7702的共培養(yǎng)體系中，經(jīng)LPS或H2O2刺激的LX2細(xì)胞可使HL7702細(xì)胞表達(dá)的凋亡相關(guān)蛋白Caspase 8和Caspase 3明顯增加，各組間相對(duì)表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為5.696、52.410、66.771，P值均<0.05)(圖6a、b)；同時(shí)通過(guò)Annexin V-PI染色用流式的方法進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS或H2O2刺激的LX2細(xì)胞可明顯促進(jìn)HL7702細(xì)胞的凋亡和壞死，各組間壞死、凋亡水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為217.006、127.600，P值均<0.01)(圖6c、d)。

圖5 NAC抑制LPS誘導(dǎo)的LX2炎癥

3 討論

本次研究通過(guò)尾靜脈+皮下注射人血白蛋白的方法構(gòu)建小鼠慢性肝病模型，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)腹腔注射LPS+D-GalN構(gòu)建小鼠ACLF模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠病死率達(dá)80%，肝組織HE染色可見(jiàn)大片肝細(xì)胞壞死，間質(zhì)組織塌陷，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。相較于對(duì)照組，模型組小鼠血清AST和ALT明顯升高，肝組織MDA明顯升高，SOD明顯降低，表明成功建立小鼠ACLF模型。SOD是一種重要的抗氧化酶，是清除體內(nèi)氧自由基的首要物質(zhì)[11]，ACLF發(fā)病過(guò)程中小鼠肝臟SOD水平降低，從而導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激水平升高，參與ACLF的疾病進(jìn)程。

抗氧化劑NAC有效降低模型小鼠病死率，逆轉(zhuǎn)小鼠血清、肝組織生化指標(biāo)的變化。ROS激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-6釋放，炎癥因子參與多種疾病的發(fā)病過(guò)程[12]。本研究中模型組和NAC組小鼠血清LPS水平均較對(duì)照組升高，而NAC組小鼠血清IL-1β水平較模型組明顯降低。后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，即抗氧化劑NAC有效抑制LPS或H2O2誘導(dǎo)HSC炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子IL-1β和IL-6分泌。

注：a～b, Western Blot檢測(cè)HL7702細(xì)胞凋亡蛋白Caspase3和Caspase8的表達(dá)；c～d, Annexin V-PI染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HL7702細(xì)胞的凋亡和壞死。

肝臟炎癥反應(yīng)與病毒性、酒精性、脂肪性和自身免疫肝病等多種慢性肝臟疾病的發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)。炎癥參與肝硬化、肝癌和肝衰竭等肝臟疾病的不同階段。肝衰竭是炎癥介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷、死亡過(guò)程，抑制肝臟炎癥反應(yīng)能夠阻止肝衰竭疾病進(jìn)程[13]。HSC是肝內(nèi)重要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，本研究和之前的研究都表明炎癥介質(zhì)能夠直接激活HSC的NLRP3炎癥小體，促進(jìn)HSC炎癥反應(yīng)。有研究[5]表明HSC炎癥在自身免疫性肝病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，HSC接收肝血竇內(nèi)產(chǎn)生的炎癥信號(hào)，通過(guò)自身炎癥反應(yīng)將其傳遞到肝實(shí)質(zhì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷。

HSC與竇周血管內(nèi)皮細(xì)胞(Sinusoidal endothelial cells, SEC)、Kupffer細(xì)胞(KC)共同構(gòu)成肝血竇。生理?xiàng)l件下HSC的炎癥功能相對(duì)較弱，肝臟炎癥主要由KC和SEC等細(xì)胞引發(fā)[14-15]，LPS通過(guò)Toll樣受體4激活KC、SEC分泌炎癥因子，誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)。肝衰竭時(shí)肝臟細(xì)胞大量死亡同時(shí)HSC活化增殖，HSC占肝內(nèi)固有細(xì)胞比例由正常條件下的15%上升至50%[16]，提示HSC在肝衰竭發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色。那么HSC炎癥是否參與、如何參與肝衰竭的基本進(jìn)程？針對(duì)這一問(wèn)題，本研究在LX2細(xì)胞和HL7702細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中探究了LPS對(duì)HSC炎癥以及HSC炎癥對(duì)肝細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS或H2O2刺激LX2細(xì)胞分泌炎癥因子促進(jìn)HL7702細(xì)胞凋亡。

綜上所述，在肝衰竭的發(fā)病過(guò)程中，LPS可通過(guò)ROS促進(jìn)HSC炎癥，HSC分泌相關(guān)炎癥因子進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，參與肝衰竭的疾病進(jìn)程。調(diào)控炎癥或氧化應(yīng)激可能成為肝衰竭新的治療靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：田臻負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)、擬定寫(xiě)作思路；王麗莎、姚耐娟負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫(xiě)；田臻、王麗莎負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析；田臻、趙英仁、阮驪濤負(fù)責(zé)論文審定。