田 樂，王穎航，潘 志

1 長春中醫(yī)藥大學 人參科學研究院，長春130117； 2 長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 風濕科，長春130117

肝纖維化是慢性肝損傷后的一種自我修復過程，特征是細胞外基質(zhì)(ECM)的合成和降解失衡，導致明顯的ECM沉積。其原因多種多樣，例如肝炎病毒感染，自身免疫性肝病以及酒精性脂肪肝或代謝相關(guān)脂肪性肝病[1-2]。肝纖維化最終可能發(fā)展為肝硬化、肝衰竭和肝癌，這極大地影響了患者的生存和生活質(zhì)量[3]。在肝病誘發(fā)纖維化因子后，肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化的主要效應細胞。但是，肝纖維化的分子機制尚待確定，也缺乏有效的藥物來防治肝纖維化。

消癥活絡方(XZHLF)為作者研究團隊的臨床經(jīng)驗方[4]，臨床效果顯著，代東雪等[5]研究表明消癥活絡方能夠明顯改善大鼠肝纖維化程度，其作用機制可能是通過降低TGFβ1的表達，從而抑制HSC的活化，降低ECM的合成。唐成芳等[4]研究表明消癥活絡方含藥血清能抑制TGFβ1誘導的HSC-T6增殖；消癥活絡方可改善肝痹患者的臨床癥狀和相關(guān)的生化指標。

隨著網(wǎng)絡藥理學的飛速發(fā)展，基于網(wǎng)絡藥理學的分析成為一種揭示中草藥復雜機制的新方法。中藥在治療中具有多組分和多靶標的特點。因此，新方法與中醫(yī)相結(jié)合可以促進研究從單一藥物靶標轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟M分靶標網(wǎng)絡[6]。因此，筆者通過網(wǎng)絡藥理學方法預測了XZHLF抗肝纖維化的潛在作用機制，并在前期評估XZHLF的抗肝纖維化作用的基礎上，使用CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型通過體內(nèi)藥理實驗進行驗證。

1 資料與方法

1.2 XZHLF“藥物-活性成分”網(wǎng)絡構(gòu)建 將XZHLF各中藥與各中藥活性成分相匹配，采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-活性成分”網(wǎng)絡圖。

1.3 肝纖維化疾病靶點的獲取 通過GeneCards、OMIN數(shù)據(jù)庫，以“Hepatic Fibrosis”為關(guān)鍵詞檢索，得到肝纖維化疾病靶點，利用韋恩圖將2個數(shù)據(jù)庫結(jié)果取并集得到肝纖維化疾病靶點的全部信息。

1.4 XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點的獲取 將獲得的肝纖維化疾病靶點與上述獲得的活性成分靶點利用韋恩圖取交集，得到XZHLF防治肝纖維化的潛在作用靶點。

1.5 XZHLF防治肝纖維化的“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建 將XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點與XZHLF各中藥活性成分相匹配，采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡圖。

1.6 KEGG通路富集分析和GO生物過程富集分析 將XZHLF防治肝纖維化的潛在作用靶點的Gene Symbol導入Metascape數(shù)據(jù)庫，進行KEGG通路富集分析和GO生物過程富集分析并保存結(jié)果。選取滿足P<0.001的通路，并根據(jù)富集基因數(shù)量降序排序，選取富集基因數(shù)最多的前20條，使用微生信網(wǎng)站繪制氣泡圖。

1.7 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構(gòu)建 本研究針對前20條KEGG通路中的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路進行研究，篩選出富集在MAPK信號通路上的靶點、與這些靶點相應的XZHLF活性成分以及與這些XZHLF活性成分相映射的其他通路，結(jié)合上述三者，利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建出“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡關(guān)系圖。

1.8 Western Blot法驗證XZHLF對細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)通路蛋白表達的影響

1.8.1 動物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量150～180 g，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司[實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(吉)-2018-0007；實驗動物使用許可證編號：SYXK(吉)2018-0014]。

均質(zhì)后的料液放入酶解器中，預熱至45 ℃后恒溫，用20%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0～9.0左右，再按2%～5%投料量將重組胰蛋白酶投入(添加胰蛋白酶的目的是利用胰蛋白酶將鰻魚肉蛋白水解成氨基酸，得到高含鈣的復合氨基酸混合液，再經(jīng)均質(zhì)、噴霧干燥等工藝生產(chǎn)蛋白鈣及蛋白粉產(chǎn)品，通過前期實驗研究表明胰蛋白酶對鰻魚肉的酶解效率高)，攪拌20 min，然后加熱至60～80 ℃(10 min),使原料酶解。

1.8.2 儀器與試劑 SK-O180-E水平搖床，大龍興創(chuàng)實驗儀器；165-8000電泳儀，170-3930轉(zhuǎn)膜儀(濕轉(zhuǎn))，美國Bio-Rad公司；全自動低溫離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；酶標儀，深圳雷杜生命科學股份有限公司；立式鼓風干燥箱，上海和呈儀器制造有限公司。黃芪、穿山甲、鱉甲、鉤藤、紅景天，北京同仁堂制藥集團長春分店；秋水仙堿，云南植物藥業(yè)有限公司；CCl4(分析純)，天津致遠化學試劑有限公司；植物油，中糧食品營銷有限公司；RIPA裂解液、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠ERK5、p-ERK5和MEKK3多克隆抗體，美國CST公司；兔抗大鼠MEK5多克隆抗體，Abcam公司；ECL發(fā)光液，北京全式金生物技術(shù)有限公司；

1.8.3 方法 按比例稱取所需劑量的中藥飲片，按常規(guī)水煎法煎煮，最后合并濾液并濃縮(含生藥量1.96 g/ml)，4 ℃保存?zhèn)溆?。健康SD大鼠60只，隨機分為空白對照組(K組)，模型組(M組)，秋水仙堿陽性對照組(Y組)，XZHLF高(G組)、中(Z組)、低(D組)劑量組6組，每組10只。除K組，其余各組大鼠按體質(zhì)量背部皮下注射40%CCl4油劑3 ml/kg(首次注射5 ml/kg)[7-8]，K組給予等量體積生理鹽水，每周二、周五各1次，持續(xù)8周。造模同時給藥，G、Z、D組按照4.9 g/kg、9.8 g/kg、19.6 g/kg大鼠體質(zhì)量灌胃給藥，Y組按 0.1 mg/kg大鼠體質(zhì)量灌胃給藥，M組和K組按10 ml/kg大鼠體質(zhì)量灌胃給蒸餾水，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥8周。給藥結(jié)束后禁食12 h，取各組大鼠肝組織100 mg，放入預冷的研缽中，液氮研磨，加0.75 ml RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，取蛋白樣品至EP管中，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，混勻，95 ℃～100 ℃煮5 min。采用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(40 μg)。將分離的蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，1×TBST洗膜3次，每次5 min，然后將其浸入5%脫脂奶粉的TBST中常溫水平搖床搖晃封閉2 h。1×TBST洗膜3次，每次5 min，用ERK5(1∶1000)、p-ERK5(1∶1000)、MEK5(1∶1000)、MEKK3(1∶1000)和β-actin(1∶1000)一抗孵育，4℃過夜。1×TBST洗膜3次，每次5 min，加入HRP標記的羊抗兔第二抗體(1∶1000)，常溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次5 min，ECL化學發(fā)光法獲取膠片，測定灰度值。

1.9 倫理學審查 研究方案經(jīng)由長春中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會審批，批號：20190035，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分及靶點 對XZHLF各中藥進行ADME篩選，以GI absorption=High、Drug likeness>2個yes為限定條件，篩選出110個活性成分，分別從黃芪、穿山甲、鱉甲、鉤藤、紅景天中篩選45、13、13、41、16個活性成分，其中天冬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、酪氨酸、纈氨酸為穿山甲與鱉甲共有活性成分，脯氨酸為鱉甲、穿山甲和黃芪共有活性成分，山奈酚為鉤藤、黃芪和紅景天共有活性成分，槲皮素為鉤藤、黃芪和紅景天共有活性成分，香豆素為黃芪和紅景天共有活性成分。在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲取923個XZHLF各中藥活性成分靶點。

2.2 XZHLF“藥物-活性成分”網(wǎng)絡構(gòu)建 將XZHLF各中藥、XZHLF各中藥活性成分、XZHLF各中藥活性成分靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件，并進行網(wǎng)絡拓撲分析，構(gòu)建“藥物-活性成分”網(wǎng)絡圖。此網(wǎng)絡共涉及115個節(jié)點，128條邊(圖1)。

2.3 肝纖維化疾病靶點 將GeneCards、OMIN數(shù)據(jù)庫獲得的肝纖維化疾病靶點導入到微生信網(wǎng)站，制作韋恩圖，取并集得到6823個肝纖維化疾病靶點(圖2)。

2.4 XZHLF防治肝纖維化的潛在作用靶點 將肝纖維化疾病靶點與XZHLF各中藥活性成分靶點導入到微生信網(wǎng)站，制作韋恩圖，取交集得到647個XZHLF防治肝纖維化的潛在作用靶點(圖3)。

2.5 XZHLF防治肝纖維化的“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建 將XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點與XZHLF各中藥活性成分導入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡圖。因網(wǎng)絡過于復雜，故通過網(wǎng)絡拓撲分析，取Degree值≥15的潛在作用靶點與XZHLF各中藥活性成分構(gòu)建網(wǎng)絡。此網(wǎng)絡共涉及170個節(jié)點，1950條邊(圖4)。

2.6 XZHLF防治肝纖維化的KEGG通路富集分析和GO生物過程富集分析 KEGG通路富集分析和GO生物過程富集分析中P值代表富集程度由顏色表示，count值代表富集基因數(shù)由氣泡大小表示，橫坐標代表基因比例，縱坐標代表信號通路名稱。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點與MAPK信號通路關(guān)系較為密切(圖5)。GO生物過程富集分析發(fā)現(xiàn)，XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點與MAPK級聯(lián)反應的調(diào)控關(guān)系較為密切(圖6)。

注：類三角形代表XZHLF各中藥，圓形代表XZHLF各中藥活性成分并用不同的顏色標記，其中粉色代表各中藥共有的活性成分，圓形面積越大代表XZHLF各中藥活性成分連接的XZHLF各中藥活性成分靶點越多。

圖2 肝纖維化疾病靶點韋恩圖

2.7 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡 將富集在MAPK信號通路上的靶點、與這些靶點相應的XZHLF活性成分以及與這些XZHLF活性成分相映射的其他通路導入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡關(guān)系圖，該圖共有156個節(jié)點，744條邊(圖7)。

2.8 XZHLF對ERK5通路基因表達的影響 WesternBlot結(jié)果顯示，M組的大鼠肝組織內(nèi)ERK5、p-ERK5、MEK5和MEKK3蛋白水平較K、Y、G、Z、D組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；K組的大鼠肝組織內(nèi)ERK5、p-ERK5、MEK5和MEKK3蛋白水平較Y、G、Z、D組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(圖8)。

圖3 XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點韋恩圖

注：圖中粉色圓形代表XZHLF各中藥活性成分，圓形面積越大代表XZHLF各中藥活性成連接的XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點越多；藍色菱形代表XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點，菱形面積越大代表XZHLF防治肝纖維化潛在作用靶點連接的XZHLF各中藥活性成分越多。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 GO分類富集分析氣泡圖

注：綠色圓形代表XZHLF活性成分，藍色菱形代表富集在MAPK信號通路上的靶點，橙色類三角形代表信號通路。

3 討論

中醫(yī)學的“血瘀”、“癥瘕痞塊”與現(xiàn)代醫(yī)學纖維組織增生性疾病具有密切相關(guān)性。肝纖維化可歸屬為脅痛、黃疸、痞塊、癥瘕、積聚等范疇[9]。目前研究[10]認為，肝纖維化是肝硬化的早期可逆階段，還未形成堅硬不移的腫塊，為有形之癥瘕的早期，是探求有效藥物治療肝硬化道路上的一個重要突破點。其中醫(yī)治療方法目前可采用解毒化濕、益氣養(yǎng)陰，消癥散結(jié)、化痰通絡等方法[11]。XZHLF由黃芪、穿山甲、鱉甲、鉤藤、紅景天五味中藥組成，具有消癥散結(jié)，扶正活絡的作用。

通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)XZHLF可能通過MAPK信號通路防治肝纖維化。真核細胞內(nèi)已確定有4條MAPK信號通路, 即細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2) 通路、c-Jun氨基末端激酶 (JNK) 通路、p38MAPK通路以及ERK5通路[12]。ERK5以三級激酶級聯(lián)反應方式進行級聯(lián)反應，首先刺激因素先激活MEKK2/3，然后由激活的MEKK2/3激活MEK5，最后激活的MEK5再去激活ERK5[13-14]。MEK5是目前發(fā)現(xiàn)ERK5唯一的上游激酶。MEK5對ERK5具有高度特異性，即使過表達了也不會激活MAPK家族的其他成員[15]。研究表明，ERK5與細胞的生存、增殖和分化有著密切的聯(lián)系。ERK5通路對于心血管系統(tǒng)的胚胎發(fā)育具有重要作用[16]，在神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)揮重要作用[17]。有研究[18]表明ERK5信號通路在腎小球系膜細胞的病理生理過程中起重要作用，能夠誘導系膜細胞收縮、增殖和細胞外基質(zhì)積聚。Ramsay等[19]研究表明，ERK5介導的信號對前列腺原位轉(zhuǎn)移癌模型有顯著的促進形成作用。Urushihara等[20]研究表明，在慢性腎小球腎炎中，磷酸化的ERK5能夠促進細胞活性和ECM的堆積?，F(xiàn)有研究表明，MAPK家族的ERK5通路能夠通過調(diào)節(jié)ECM的表達促進纖維化的發(fā)展，故本研究通過實驗驗證XZHLF可能通過ERK5通路來防治肝纖維化。

注：與K組比較，*P<0.05;與M組比較，#P<0.05。

本研究的結(jié)果表明，與K組相比較，M組大鼠肝組織內(nèi)ERK5和p-ERK5蛋白的表達水平明顯升高，同時作為ERK5級聯(lián)反應中的上游蛋白MEK5和MEKK3蛋白的表達水平也隨之明顯升高，ERK5通路被激活，蛋白表達水平明顯增加；G、Z、D組與M組相比較，ERK5通路級聯(lián)反應中的ERK5、p-ERK5、MEK5和MEKK3蛋白的表達水平均有所降低，ERK5通路受到抑制，其中G組抑制的作用最為明顯。XZHLF對肝纖維化大鼠肝組織中的ERK5通路起到明顯的抑制作用，降低了ERK5在肝組織中的含量。提示XZHLF抑制肝纖維化可能是通過抑制ERK5通路的激活，減少ECM的表達實現(xiàn)的，但其中的作用機制還不明確，需要更深一步的探索研究。

綜上，本研究從網(wǎng)絡藥理學角度揭示了XZHLF防治肝纖維化可能的分子機制，并實驗驗證了XZHLF可能是通過抑制ERK5通路的激活，減少ECM的表達實現(xiàn)抑制肝纖維化的。為XZHLF的進一步藥效物質(zhì)基礎分析和作用機制考察提供了參考依據(jù)，同時也使以后的相關(guān)研究更有針對性。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：田樂負責課題設計，資料分析，撰寫論文；王穎航參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；潘志負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。