張 瑋， 楊廣越， 沈東曉， 馬文婷， 陶 樂， 吳 柳， 嚴(yán) 萍， 劉 成

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院 a.實驗中心肝病實驗室， b.感染科， 上海 200062

肝纖維化是機(jī)體對多種慢性損傷的一種修復(fù)應(yīng)答，以細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征[1]，可發(fā)展為肝硬化導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥[2]，包括門靜脈高壓、肝衰竭和肝細(xì)胞癌[3]。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)是TGFβ超家族成員[4]，課題組前期發(fā)現(xiàn)GDNF通過ALK5/Smad信號促進(jìn)肝星狀細(xì)胞(HSC)活化和肝纖維化[5]，因此抑制GDNF可能是抗肝纖維化的新靶點。

下瘀血湯出自漢·張仲景《金匱要略》，由大黃、桃仁、土鱉蟲3味中藥組成，三藥合用共奏活血化瘀之功，課題組前期用其治療肝纖維化取得了良好的臨床療效[6]，并發(fā)現(xiàn)下瘀血湯抗肝纖維化主要通過抑制NF-κB和TGFβ1/Smad信號通路[7]；減少腸上皮細(xì)胞凋亡，減輕緊密連接的破壞而抑制肝纖維化進(jìn)展等[8]。但下瘀血湯是否能通過調(diào)控GDNF來抗肝纖維化還需要進(jìn)一步探究。本文采用CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，以肝纖維化過程中GDNF表達(dá)及功能為切入點，觀察下瘀血湯通過抑制GDNF來抗肝纖維化的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性C57BL/6小鼠，清潔級，18～20 g，購自上海斯萊克實驗動物公司，生產(chǎn)許可證號：SYXK(滬)2017-0005。小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實驗動物中心，使用許可證號：SYXK(滬)2018-0032。飼養(yǎng)室環(huán)境溫度為(22±1)℃，相對濕度為30%～60%，12 h光照/12 h黑暗，自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 細(xì)胞 GFP-Col-HSC細(xì)胞由美國加州大學(xué)圣地亞哥分校Ekihiro Seki教授饋贈，人原代HSC細(xì)胞購自Sciencell公司(貨號：5300)。GFP-Col-HSC細(xì)胞培養(yǎng)于2%FBS+1%青霉素和鏈霉素的DMEM中，人原代HSC細(xì)胞培養(yǎng)于10%FBS+1%青霉素和鏈霉素的DMEM中。

1.1.3 藥物 下瘀血湯所含的大黃、桃仁、地鱉蟲購自上海華宇藥業(yè)。下瘀血湯由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制備，其制備過程如下：大黃2.0 kg、桃仁2.0 kg和地鱉蟲1.2 kg，分別加入8倍量20%乙醇浸泡1 h，回流提取2次，過濾收集藥汁；藥渣再加6倍量20%乙醇回流提取1 h，過濾收集藥汁。合并兩次所收集的藥汁、真空干燥，每克所含生藥量為8.889 g，臨用前配制成濃度為0.63 g/ml的藥液[8]。

1.1.4 試劑及耗材 CCl4和橄欖油購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；ALT(貨號：C009-2-1)、AST(貨號：C010-2-1)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；天狼星紅染色液由上海中醫(yī)藥大學(xué)劉平教授饋贈；SABC免疫組化試劑盒購自Vector公司；FBS購自TPCS公司；青霉素和鏈霉素及胰酶均購自美國Gibco公司；DMEM購自以色列BI公司；GDNF因子購自R&D公司；PVDF膜購自Millipore公司；BSA購自Amresco公司；ECL購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)兔單克隆抗體和GDNF兔多克隆抗體均購自Abcam公司；Trizol、High-Capacity cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR均購自日本TaKaRa公司；DAB購自北京中杉金橋公司；96孔板、6孔板均購自美國Corning公司；10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿購自NEST公司；引物購自生工生物工程公司(表1)。

1.1.5 主要儀器 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、多功能酶標(biāo)儀、超微量分光光度計、實時熒光定量PCR儀、脫水機(jī)、包埋機(jī)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、染色機(jī)、封片機(jī)等病理設(shè)備均購自德國Leica公司，熒光顯微鏡為日本Olympus公司(BX52)；蛋白電泳儀及濕轉(zhuǎn)儀均購自Bio-RAD公司，顯影儀購自美國GE公司。

表1 引物序列表

1.2 分組與造模處理 24只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和下瘀血湯組，每組各8只，參考課題組前期文獻(xiàn)[7]，模型組和下瘀血湯組小鼠腹腔注射10% CCl4，每周3次，連續(xù)6周；對照組小鼠相同時間腹腔注射等體積橄欖油。造模第4周起，下瘀血湯組小鼠給予0.467 8 g/kg(相當(dāng)于臨床等70 kg成人體質(zhì)量的10倍量)灌胃，對照組和模型組給予等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)3周。實驗結(jié)束2%的戊巴比妥鈉麻醉后下腔靜脈取血，留取肝組織。選取肝右側(cè)最厚一葉于10%中性福爾馬林固定后用于組織學(xué)觀察，其余肝組織用液氮處理后保存于-80 ℃冰箱。

1.3 研究方法

1.3.1 肝功能檢測 血液樣本于室溫靜置3 h，3000 r/min離心10 min，取血清，檢測小鼠血清ALT和AST水平。

1.3.2 肝組織病理學(xué)蘇木素-伊紅(HE)染色 選取肝右側(cè)最厚一葉，取0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm大小肝組織，固定于10%中性福爾馬林溶液，自動脫水機(jī)逐級乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色。采用OlympusBX43顯微鏡和CellSenStandard 9.0軟件和Olympus DP72拍照，隨機(jī)選取4個視野，進(jìn)行圖片采集。

1.3.3 免疫組化 將制備的肝組織樣本脫蠟至水后，PBS洗3次，每次3 min；檸檬酸鈉溶液微波修復(fù)抗原(100%火力，10 min；轉(zhuǎn)換50%火力，5 min)，恢復(fù)至室溫，PBS洗3次；樣本上滴加3%過氧化氫，37 ℃孵育15 min；PBS洗；滴加5%BSA，37 ℃封閉30 min；滴加α-SMA(1∶500)、GDNF(1∶100)，4 ℃過夜；PBS洗；二抗37 ℃孵育30 min；PBS洗；滴加A+B試劑，37 ℃孵育30 min；PBS洗；滴DAB鏡驗；蘇木素復(fù)染20 s，水洗；脫水；透明；封片；顯微鏡下觀察。采用Image-pro plus 6.0軟件對α-SMA和GDNF陽性表達(dá)分析。

1.3.4 Western Blot與PCR檢測 取50 mg肝組織加入預(yù)冷的RIPA中勻漿，4 ℃ 12000 r/min離心15 min，取上清進(jìn)行蛋白定量。取20 μg樣品，12% SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)移1 h至PVDF膜，5% BSA 封閉 1 h，一抗 4 ℃過夜，二抗室溫60 min，ECL顯影，采用 Image J分析Western Blot蛋白表達(dá)灰度值。(1)總RNA的提?。篢rizol法提取小鼠肝臟RNA，總RNA溶解于DEPC水，采用超微量分光光度計測定A260/280 nm吸光度值，檢測RNA濃度；(2)逆轉(zhuǎn)錄：按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)說明書操作，PCR反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 15 min。(3) PCR擴(kuò)增：cDNA 3 μl加SYBR Green 5 μl，引物0.8 μl，，ddH2O 1.2 μl，總體積10 μl，ABI(VIIA 7 DX)PCR系統(tǒng)擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 min；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，延伸60 ℃ 1 min。2ΔΔCt法分析結(jié)果。

1.4 倫理學(xué)審查 所有的研究規(guī)程均符合上海中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會當(dāng)前的倫理考慮和《中國動物保護(hù)法》的程序和倫理指導(dǎo)方針，該法符合國家研究委員會的規(guī)定。所有動物實驗和程序均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動物保護(hù)與利用委員會(IACUC)審查和批準(zhǔn)，并按照有關(guān)指導(dǎo)方針和規(guī)章執(zhí)行，倫理審查批號：PTEC-A-2016-4(G)-1。

2 結(jié)果

2.1 下瘀血湯對CCl4肝纖維化小鼠肝功能有顯著改善作用 與對照組小鼠相比，模型組ALT和AST水平顯著升高(P值均<0.001)；與模型組相比，下瘀血湯組小鼠血清ALT、AST水平顯著降低(P值均<0.01)，提示下瘀血湯對CCl4誘導(dǎo)的肝功能損傷具有保護(hù)作用(表2)。

表2 各組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平

2.2 下瘀血湯對CCl4肝纖維化的抑制作用 HE染色結(jié)果顯示，對照組肝細(xì)胞索從中央靜脈呈放射狀排列，CCl4造模6周后小葉間炎性細(xì)胞浸潤明顯，下瘀血湯可顯著抑制炎性浸潤(圖1a～c，表3)。天狼星紅染色結(jié)果顯示，CCl4造模6周，膠原纖維沉積顯著增多，正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，增生的膠原從匯管區(qū)向小葉延伸，形成肝纖維化，下瘀血湯顯著抑制膠原沉積(圖1d～f，表3)。

表3 各組小鼠炎性浸潤半定量及天狼星紅陽性半定量結(jié)果

2.3 下瘀血湯顯著抑制CCl4肝纖維化模型中HSC活化和GDNF表達(dá) 正常肝組織α-SMA 表達(dá)較低，主要表達(dá)在中央靜脈血管壁，造模6周，α-SMA呈強陽性表達(dá)，主要分布在纖維間隔和肝竇；下瘀血湯處理組α-SMA表達(dá)顯著下調(diào)。GDNF在正常小鼠肝組織表達(dá)較低，呈弱陽性表達(dá)；模型組小鼠肝組織GDNF主要表達(dá)肝小葉周圍，呈強陽性表達(dá)，位置與α-SMA表達(dá)位置類似(圖2，表4)。

表4 各組小鼠肝臟組織中α-SMA及GDNF含量半定量分析

免疫印跡結(jié)果顯示，對照小鼠肝組織GDNF表達(dá)比較低，CCl4造模6周肝纖維化形成，GDNF表達(dá)上調(diào)10倍左右，下瘀血湯顯著抑制GDNF蛋白表達(dá)。α-SMA和Col1表達(dá)在肝纖維化中顯著上調(diào)，下瘀血湯處理后α-SMA與Col1顯著下降(圖3，表5)。

圖3 α-SMA及GDNF在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化中的免疫印跡(n=4)

表5 各組小鼠肝臟組織中α-SMA及GDNF含量灰度值半定量分析

2.4 下瘀血湯對GDNF誘導(dǎo)的HSC活化有抑制作用 用GDNF處理人原代HSC細(xì)胞2 h，發(fā)現(xiàn)磷酸化(p)NF-κB水平顯著升高，提示GDNF可誘導(dǎo)NF-κB活化，下瘀血湯處理后p-NF-κB水平顯著下調(diào)，提示下瘀血湯對GDNF誘導(dǎo)的NF-κB活化有顯著抑制作用；同樣GDNF可誘導(dǎo)TNFα表達(dá)顯著上調(diào)，而下瘀血湯可顯著抑制GDNF誘導(dǎo)的TNFα表達(dá)(圖4a，表6)。

GFP-Col-HSC細(xì)胞是小鼠源性的HSC株，當(dāng)其活化時表達(dá)膠原Col和GFP。GFP-Col-HSC細(xì)胞培養(yǎng)48 h，不處理組GFP-Col-HSC細(xì)胞熒光強度相對較弱，而GDNF 10 ng/ml處理48 h，GFP-Col-HSC細(xì)胞熒光顯著增強，提示GDNF可誘導(dǎo)HSC活化；下瘀血湯處理后，GFP-Col-HSC熒光強度顯著下降，提示下瘀血湯對GDNF誘導(dǎo)的HSC活化有顯著的抑制作用(圖4c)。

進(jìn)一步采用人原代HSC細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-SMA和Col1表達(dá)上調(diào)2.7倍和4.8倍，提示GDNF可誘導(dǎo)人HSC活化，下瘀血湯處理后α-SMA和Col1表達(dá)顯著下調(diào)，提示下瘀血湯對GDNF誘導(dǎo)的人HSC活化有顯著抑制作用(圖4b，表6)。實時定量PCR結(jié)果與免疫印跡結(jié)果類似，Col4 A2和Col5 A1在GDNF刺激后顯著上調(diào)，而下瘀血湯顯著抑制GDNF誘導(dǎo)的Col4 A2和Col5 A1表達(dá)(表7)。

表6 體外實驗中炎癥因子及纖維化指標(biāo)灰度值半定量分析

表7 體外實驗中纖維化相關(guān)因子mRNA相對表達(dá)量比較

注：a，人原代HSC細(xì)胞在GDNF(10 ng/ml)濃度下處理2 h; b, 免疫印跡檢測α-SMA和Col1表達(dá)及半定量結(jié)果；c,GDNF處理GFP-Col-HSC細(xì)胞48 h，檢測熒光。

3 討論

在我國慢性乙型肝炎是肝纖維化主要病因，近年乙型肝炎疫苗的廣泛應(yīng)用，乙型肝炎肝纖維化顯著減少[9]，然而，生活節(jié)奏改變誘發(fā)的非酒精性脂肪性肝病[10]、酒精性脂肪性肝病[11]、藥物性肝損傷、自身免疫性肝炎等慢性肝病不斷增多，這些慢性肝病均可誘發(fā)肝纖維化，進(jìn)而誘發(fā)門靜脈高壓和肝癌[3]。肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是HSC，在持續(xù)的慢性肝損傷情況下，HSC及Kuffer細(xì)胞及肝細(xì)胞分泌TGFβ，通過自分泌或旁分泌途徑刺激HSC活化，進(jìn)而分泌膠原致細(xì)胞外基質(zhì)增多和肝纖維化[12]。肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)明確，然而仍然缺乏有效的生物或化學(xué)藥物干預(yù)，提示肝纖維化的病因研究有待進(jìn)一步深入。目前明確了肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是HSC激活，激活的 HSC 是肝纖維化過程中細(xì)胞基質(zhì)外主要來源，TGFβ是致 HSC激活的最強因子，但由于 TGFβ細(xì)胞分布的廣泛性，靶向 TGFβ分子的生物制劑很難走向臨床應(yīng)用。因此，這就要求從新的視角，進(jìn)一步闡明 HSC 激活機(jī)制，以便為其有效防治提供新靶點。

下瘀血湯是抗肝纖維化經(jīng)典方劑，已故名醫(yī)姜春華教授用下瘀血湯治療血吸蟲性肝纖維化取得較好的臨床療效[13]。本課題組發(fā)現(xiàn)下瘀血湯對膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)肝纖維化[14]及蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的脂肪變及纖維化有顯著抑制作用[15]，并對肝纖維化過程中的其他臟器損傷也有顯著的保護(hù)作用[16]。本研究肝功能、天狼星紅染色等結(jié)果驗證了下瘀血湯抗肝纖維化作用，與前期結(jié)果一致[14-15]。基礎(chǔ)研究結(jié)果為下瘀血湯臨床應(yīng)用提供了依據(jù)，并且下瘀血湯僅有三味中藥組成，較容易闡明藥物的有效成分，有巨大的開發(fā)潛力，因此，進(jìn)一步闡明下瘀血湯的作用機(jī)制具有重要意義。

GDNF是TGFβ超家族成員[4]，TGFβ是最強致纖維化因子，但是TGFβ分布組織廣泛，缺乏組織和細(xì)胞特異性，針對TGFβ靶向的試劑很難走向臨床，需要尋找細(xì)胞特異性較好的致纖維化新靶點。本研究顯示GDNF主要分布在小葉間，與α-SMA分布相似，體外GDNF處理GFP-Col-HSC及人原代HSC 48 h，膠原表達(dá)上調(diào)，提示GDNF可誘導(dǎo)HSC細(xì)胞活化，具有致纖維化作用，與文獻(xiàn)報道GDNF可促進(jìn)纖維化反應(yīng)作用一致[5,17-18]。GDNF相對TGFβ有致纖維化作用并具特異性，本課題組發(fā)現(xiàn)了HSC活化的這個新靶點，為中醫(yī)藥抗肝纖維化提供了新的靶標(biāo)。

本研究創(chuàng)新之處是發(fā)現(xiàn)GDNF處理HSC 2 h后，NF-κB磷酸化水平和TNFα表達(dá)顯著增高，提示GDNF可經(jīng)過NF-κB通路誘導(dǎo)HSC活化，下瘀血湯可顯著抑制GDNF誘導(dǎo)的NF-κB通路從而抗肝纖維化，因此，在一定程度上闡明了下瘀血湯抗肝纖維化的作用機(jī)制。據(jù)報道GDNF在炎性疼痛中發(fā)揮重要作用[19]，前期本組報道下瘀血湯可顯著改善慢性乙型肝炎患者肝區(qū)不適、脅痛等臨床癥狀[6]，因此，GDNF也可能是脅痛的病理基礎(chǔ)之一，也是下瘀血湯取效的靶點之一?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)GDNF在肝纖維化過程中上調(diào)并可經(jīng)過NF-κB誘導(dǎo)HSC活化，下瘀血湯抑制GDNF的表達(dá)從而實現(xiàn)抗肝纖維化效應(yīng)，為未來臨床應(yīng)用下瘀血湯抗肝纖維化提供了基礎(chǔ)依據(jù)，但下瘀血湯抗纖維化機(jī)制及有效成分的作用需要進(jìn)一步深入研究。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：張瑋負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；楊廣越、沈東曉、嚴(yán)萍負(fù)責(zé)分子生物學(xué)相關(guān)實驗及動物實驗；馬文婷、陶樂、吳柳參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉成負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。