李瀟然，王娟，王世東，姜淼，張華，顧浩

木賊-青葙子藥對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變作用機制網(wǎng)絡藥理學研究

李瀟然1，王娟2，王世東1，姜淼2，張華1，顧浩2

1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；2.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所，北京 100700

運用網(wǎng)絡藥理學方法探討木賊-青葙子藥對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機制。應用TCMSP、ETCM、Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索木賊和青葙子藥物成分及靶點，應用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索糖尿病視網(wǎng)膜病變基因，通過Venny軟件獲得交集靶點，利用Cytoscape3.6.1軟件構建靶點關系網(wǎng)絡，錄入String平臺構建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡，并應用RGUI軟件對靶點進行GO功能及KEGG通路富集分析。篩選出木賊活性成分10個，青葙子活性成分2個，β-谷甾醇為兩藥共有成分。獲得木賊靶基因295個，青葙子靶基因88個，疾病基因共2702個，疾病-藥物交集靶點134個，PPI網(wǎng)絡核心靶點為JUN、MAPK1、RELA、AKT1、TNF。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，靶點所在的細胞組分主要為膜區(qū)，生物學過程主要富集在脂多糖應答及氧化應激反應，分子功能主要為調(diào)節(jié)細胞因子活性和調(diào)節(jié)細胞因子受體結合。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，糖基化終末產(chǎn)物通路為核心通路。木賊-青葙子藥對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機制涉及多種復雜的生物學過程，主要作用靶點集中在膜區(qū)由糖基化終末產(chǎn)物介導的AGE→RAGE通路中，針對視網(wǎng)膜血管的炎癥、壞死、增殖等諸多病理過程。

木賊；青葙子；糖尿病視網(wǎng)膜病變；網(wǎng)絡藥理學

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，是導致成年人失明的主要原因之一[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病隱匿，早期無明顯癥狀，難以及時發(fā)現(xiàn)，后期隨著新生血管的破裂出血，導致視力不可逆下降，嚴重影響患者生活質量。目前西醫(yī)以降糖、降脂、降壓及改善循環(huán)等內(nèi)科治療為主，配合眼科專科激光治療[2]，多用于病變早期以延緩疾病進展，對中晚期病變治療效果差。

糖尿病視網(wǎng)膜病變相當于中醫(yī)學“消渴病視瞻昏渺”，消渴日久氣陰兩虛，因虛致瘀，目絡瘀阻，在疾病發(fā)展過程中可兼有肝氣郁結、肝經(jīng)郁熱、痰濕阻滯等證候[3]。國醫(yī)大師呂仁和教授在糖尿病視網(wǎng)膜病變長期臨床診療中，在對病、對癥及分期的“六對論治”[4]基礎上，對出現(xiàn)視物模糊、視力下降患者常加用木賊-青葙子藥對，具有一定臨床療效。但目前該藥對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機制尚未闡明。

網(wǎng)絡藥理學通過藥物成分、蛋白、基因靶點的關系網(wǎng)絡，研究藥物復雜成分在機體中的相互作用機制，特別適合多途徑、多靶點的中藥藥效機制研究。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法探討木賊-青葙子藥對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變作用機制，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選

應用TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/ Index/）數(shù)據(jù)庫檢索木賊、青葙子有效成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為條件篩選木賊、青葙子的活性成分。

1.2 藥物作用靶點篩選

在TCMSP、ETCM數(shù)據(jù)庫中檢索木賊、青葙子活性成分的潛在靶點。去除重復靶點后，逐一錄入Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），檢索人類的靶點蛋白名稱（official symbol）及Uniprot ID編號。

1.3 疾病靶點檢索

在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/search/advanced/geneMap）數(shù)據(jù)庫中，以“diabetic retinopathy”為檢索詞進行檢索，得到與糖尿病視網(wǎng)膜病變相關的疾病基因。

1.4 藥物靶點網(wǎng)絡構建

將疾病基因及木賊、青葙子藥物靶點分別輸入Venny2.1軟件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ index.html），篩選疾病靶點與藥物靶點的交集靶點。將交集靶點名稱、藥物名稱及藥物成分導入Cytoscape3.6.1軟件進行可視化分析，形成藥物靶點網(wǎng)絡圖。

1.5 靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡構建

將疾病與藥物交集靶點錄入String11.0平臺（https://string-db.org/）構建蛋白相互作用（protein- protein interaction，PPI）網(wǎng)絡，蛋白種類設置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設為“highest confidence”，其他參數(shù)保持默認設置，獲得PPI網(wǎng)絡圖。應用RGUI3.61軟件，計數(shù)所有靶基因連接的靶點數(shù)目，取前30位作為核心靶點，制作連接靶點數(shù)目的柱狀圖。

1.6 基因功能及通路分析

應用RGUI3.61軟件載入org.Hs.eg.db 3.10.0，將疾病與藥物交集靶基因進行匹配并獲取entrezIDs，利用RGUI軟件及Bioconductor-clusterProfiler3.14工具對交集基因進行GO功能富集分析，包括分子功能（MF）、生物學過程（BP）及細胞組分（CC），限定＜0.01、＜0.05，生成柱狀圖；利用RGUI軟件及Bioconductor-pathview1.26工具進行KEGG通路富集分析，限定檢索類型為人類基因，且＜0.01、＜0.05，生成KEGG通路圖，再將交集基因標記在通路上。

2 結果

2.1 藥物主要活性成分及對應靶基因

篩選得到木賊主要活性成分10個，青葙子主要活性成分2個，其中β-谷甾醇（beta-sitosterol）為兩藥共有成分，藥物活性成分及其OB、DL見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索藥物活性成分作用靶點，去除重復靶點后，共獲得木賊作用靶點295個，青葙子作用靶點88個。

2.2 疾病靶點及藥物-疾病靶點網(wǎng)絡

通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索獲得糖尿病視網(wǎng)膜病變疾病基因共2702個。將295個木賊靶點、88個青葙子靶點與2702個疾病靶點取交集，共獲得疾病-藥物交集靶點134個，其中木賊與疾病交集基因132個，青葙子與疾病交集基因30個，三者交集基因28個。將藥物名稱、藥物成分及疾病-藥物交集靶點導入Cytoscape3.6.1軟件，形成木賊-青葙子藥對靶點網(wǎng)絡（見圖1）。可以看出，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PIK3CG）、熱休克蛋白90-beta（heat shock protein HSP 90-beta，HSP90AB1）等靶基因具有較高的活性成分關聯(lián)度。內(nèi)環(huán)為共有成分β-谷甾醇對應靶基因，該成分對應包括PTGS2、HSP90AB1、PIK3CG、ADRB2、原癌基因JUN（Jun proto-oncogene，JUN）在內(nèi)的多個具有較高活性成分關聯(lián)度的靶點。

2.3 靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡

將交集靶基因通過String平臺構建PPI網(wǎng)絡，結果見圖2。應用RGUI3.61軟件取前30位核心靶點，靶點關聯(lián)數(shù)目柱狀圖見圖3?？梢钥闯?，PPI網(wǎng)絡的核心靶點為JUN、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen- activated protein kinase1，MAPK1）、轉錄因子p65（transcription factor p65，RELA）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase 1，AKT1）及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。

圖3 木賊-青葙子藥對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變核心靶點關聯(lián)數(shù)目（前30位）

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

交集基因GO功能富集分析結果見圖4。分子功能中，靶基因在細胞因子活性（cytokine activity）、細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、核受體活性（nuclear receptor binding）方面富集度較高；生物學過程中，靶基因在脂多糖應答（response to lipopolysaccharide）、細菌源分子應答（response to molecule of bacterial origin）及氧化應激反應應答（response to oxidative stress）富集度高；細胞組分中，細胞膜脂筏（membrane raft）、細胞膜微結構域（membrane microdomain）及膜區(qū)（membrane region）富集度高。KEGG通路富集分析前10條核心通路見表2。生成AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications的KEGG通路圖，并將交集基因標記在通路上，結果見圖5。

MF

BP

CC

表2 木賊-青葙子藥對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變靶點KEGG通路（前10位）

圖5 木賊-青葙子藥對核心KEGG通路AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications調(diào)控圖

2.5 共有成分β-谷甾醇相關靶點KEGG通路

對β-谷甾醇對應的具有較高活性成分關聯(lián)度的6個靶點PTGS2、HSP90AB1、PIK3CG、ADRB2、JUN、CASP3進行KEGG通路富集分析，限定檢索類型為人類基因，且＜0.01、＜0.05，結果得到4條通路，見表3。

表3 β-谷甾醇相關靶點KEGG通路

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變證候特點為本虛標實、虛實夾雜。本虛多為肝腎陰虛、氣陰兩虛、陰陽兩虛，標實多為瘀血阻絡、肝氣郁結、肝經(jīng)郁熱或痰濕阻滯等[3]。青葙子味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，可清肝涼血、明目退翳，《藥性論》記載其“治肝臟熱毒沖眼，赤障、青盲、翳腫”。木賊味甘苦，性平，歸肝、肺經(jīng)，可散風熱、退目翳，《嘉佑本草》記載其“主目疾，退翳膜，消積塊，益肝膽，明目”。呂仁和教授臨床常以木賊驅散肝膽經(jīng)風熱，佐以青葙子清肝涼血，兩者配伍可加強明目退翳功效，用以治療糖尿病視網(wǎng)膜病變視物模糊、視力下降患者[5]。

從藥物靶點網(wǎng)絡圖可以看出，木賊、青葙子含有共同活性成分β-谷甾醇，其關聯(lián)靶點在網(wǎng)絡中具有較高的活性成分關聯(lián)度。同時，PPI網(wǎng)絡的核心靶點除JUN以外，AKT1、MAPK1、RELA、TNF均未關聯(lián)β-谷甾醇，僅關聯(lián)木賊的其他成分，因而推測兩者共同活性成分β-谷甾醇并非位于藥對治療機制的核心。對β-谷甾醇成分靶點的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，這些靶點在IL-17信號通路中較高程度富集，該通路為木賊-青葙子藥對與疾病相關靶點的第3條核心KEGG通路，在免疫應答及炎癥反應方面具有一定作用。由此可見，木賊、青葙子藥對在糖尿病視網(wǎng)膜病變治療中木賊起主要作用，青葙子具有協(xié)同增效作用，該協(xié)同作用主要表現(xiàn)為共有成分β-谷甾醇在減輕免疫應答及炎癥反應方面的作用。另外，青葙子的獨有成分豆甾醇（stigmasterol）關聯(lián)有不同于木賊的獨特靶點鹽皮質激素受體（NR3C2）、單胺氧化酶a（MAOA），具有調(diào)節(jié)腎上腺糖皮質激素、腎上腺鹽皮質激素及腎上腺髓質激素的作用，對該靶點的研究有助于進一步深入探索兩藥配伍后療效互補的作用機制。

GO功能富集分析結果顯示，靶點所在的細胞組分主要為膜區(qū)，生物學過程主要富集在脂多糖應答及氧化應激反應，分子功能主要為調(diào)節(jié)細胞因子活性和調(diào)節(jié)細胞因子受體結合。可見，該藥對多作用在參與糖脂代謝、免疫及氧化應激反應的細胞因子上，從而調(diào)節(jié)眾多炎癥、增生及壞死的病理過程。

從KEGG通路富集分析圖可以看出，靶基因主要富集在由糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）介導的AGE→RAGE通路。以AGE-RAGE通路下游激活的PKC→ERK1/2→AP-1通路及PI3K→AKT→NF-κB通路為核心，進而激活轉錄因子激活蛋白-1（AP-1）、核因子-κB（NF-κB）及其下游眾多基因，如轉化生長因子-β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、單核細胞趨化因子-1（MCP-1）、白細胞介素（IL）-6、TNF及黏附分子（ICAM-1、VCAM-1），誘發(fā)諸多細胞生物學反應。通路中富集的細胞因子如AKT1、JUN、MAPK1、TNF、RELA等均為PPI網(wǎng)絡核心靶點，從側面印證該通路可能為木賊-青葙子干預糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要信號通路。

PKC→ERK1/2→AP-1通路源于蛋白激酶C（PKC）的激活，被認為是參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要通路之一[6]。PKC激活可增強內(nèi)皮素-1（ET-1）的表達[7]，ET-1可使視網(wǎng)膜微小血管收縮，導致局部缺血缺氧，誘發(fā)血管增生。ET-1可激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）[8]，從而激活MAPK級聯(lián)通路的應激反應。而在MAPK多級激酶的級聯(lián)反應中，MAPK1、ERK1/2均為重要介導蛋白，參與了多種細胞過程，與糖尿病高血糖應激、氧化應激及糖尿病的慢性并發(fā)癥的發(fā)生密切相關[9]。MAPK級聯(lián)通路的激活，可間接誘導下游AP-1家族的轉錄。

PI3K→AKT→NF-κB通路是糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管形成及滲漏的關鍵通路，該通路的激活加速了病變的發(fā)生和發(fā)展[10]。本研究核心靶點AKT1是PI3K→AKT→NF-κB通路的核心基因，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）可通過激活Erk1/2進而誘導Akt1表達。周賽君等[11]研究表明，高血糖能顯著促進PI3K-Akt通路中關鍵蛋白AKT的表達，促進猴視網(wǎng)膜新生血管的形成。于佩等[12]研究表明，高糖能通過PI3K-Akt通路增加內(nèi)皮細胞凋亡。RELA是NF-κB的組成成分之一，AKT1可進一步調(diào)控下游RELA蛋白合成轉錄因子NF-κB。

從AGE-RAGE的KEGG通路圖可以看出，AP-1、NF-κB參與了AGE-RAGE通路下游諸多細胞因子通路，誘發(fā)細胞生物學反應。其中包括由IL和TNF介導的炎癥反應通路、由MCP-1及黏附分子介導的血栓炎癥及動脈硬化通路，以及由VEGF介導的新生血管反應通路。

在由IL和TNF介導的炎癥反應通路中，AP-1參與了IL-6、IL-8、MCP-1的轉錄，還可誘導多種自身免疫應答[13]。同時，NF-κB也可調(diào)節(jié)IL-6、TNF等炎癥因子，最終導致周細胞及內(nèi)皮細胞凋亡，以及動脈粥樣硬化的發(fā)生。在此炎癥反應通路中，TNF參與糖尿病視網(wǎng)膜病變多種生物學過程，可導致視網(wǎng)膜血管通透性增高，和血管內(nèi)皮細胞增殖[14]，激活小膠質細胞，協(xié)同IL-1、IL-6和其他炎性介質誘發(fā)炎癥反應，激活Caspase家族，最終誘導周細胞及內(nèi)皮細胞凋亡[15]。有研究表明，IL-6及TNF與動脈粥樣硬化密切相關[16]。另外，IL-18可通過PI3K/Akt途徑刺激巨噬細胞和內(nèi)皮細胞分泌IL-1、IL-6和TNF-α，形成炎癥反應環(huán)[17]，也可最終導致動脈粥樣硬化的發(fā)生[18]。

在MCP-1及黏附分子介導的血栓炎癥及動脈硬化通路中，MCP-1是重要的趨化因子之一。有研究顯示，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體液中MCP-1表達水平顯著增高[19]。MCP-1可誘導單核細胞及內(nèi)皮細胞表達黏附因子，增加細胞黏附，形成血栓，導致局部微循環(huán)障礙，近一步損傷視網(wǎng)膜血管，從而使糖尿病視網(wǎng)膜病變加重[20]。

由VEGF介導的新生血管反應通路是研究糖尿病視網(wǎng)膜病變的熱門通路之一。VEGF是一種血管內(nèi)皮細胞特異性的肝素結合生長因子，能作用于血管內(nèi)皮細胞，促使血管內(nèi)皮細胞增殖，在新生血管生成中起著重要作用。研究表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變黃斑水腫患者眼內(nèi)玻璃體VEGF水平顯著升高，與疾病嚴重程度一致[21]。同時，VEGF可增加黏附分子VCAM-1的表達[22]。Ye等[23]發(fā)現(xiàn)，高糖刺激糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞ERK1/2磷酸化，與AP-1結合后可增加VEGF表達，誘發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜病變。VEGF介導的新生血管反應通路是晚期糖基化通路AGEs-RAGE通路的重要組成，可造成組織不可逆損傷[24]。

本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法探討藥對配伍機制，但未考慮煎煮炮制過程中新成分產(chǎn)生的情況，藥物成分的OB、DL也以單藥數(shù)據(jù)為基礎，未考慮炮制過程中的變化。同時，網(wǎng)絡藥理學基礎數(shù)據(jù)缺乏證候相關的數(shù)據(jù)，無法探討證候層面的藥物機制。有待今后更多的藥物炮制研究及證候藥理研究的開展。

綜上所述，在木賊-青葙子藥對治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用中，木賊發(fā)揮主要作用，青葙子起一定的協(xié)同增效作用。該協(xié)同作用主要表現(xiàn)在二者共有成分β-谷甾醇在減輕免疫應答及炎癥反應方面的作用。該作用機制涉及多種復雜的生物學過程，主要作用靶點集中在膜區(qū)由糖基化終末產(chǎn)物介導的AGE→RAGE通路中，尤以AGE-RAGE通路下游激活的PKC→ERK1/2→AP-1通路及PI3K→AKT→NF-κB通路為主，進而激活AP-1、NF-κB及其下游TGF-β1、VEGF、MCP-1、IL-6、TNF等諸多細胞因子，產(chǎn)生視網(wǎng)膜血管的炎癥、壞死、增殖等病理過程，最終導致周細胞及內(nèi)皮細胞凋亡、動脈粥樣硬化發(fā)生及新生血管形成。本研究結果有待今后實驗研究進一步證實。

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Study on Mechanism of Equiseti Hiemalis Herba-Celosiae Semen Pair for Diabetic Retinopathy Based on Network Pharmacology

LI Xiaoran1, WANG Juan2, WANG Shidong1, JIANG Miao2, ZHANG Hua1, GU Hao2

To investigate mechanisms of Equiseti Hiemalis Herba - Celosiae Semen pair in treating diabetic retinopathy (DR) based on network pharmacology.The main active components and targets of Equiseti Hiemalis Herba and Celosiae Semen were obtained by TCMSP, ETCM and Uniprot Database. The diabetic retinopathy genes were collected by GeneCards and OMIM database. After that, the common targets were obtained through Venny software, and component-target network map was constructed using Cytoscape3.6.1 software. Protein-protein interaction network (PPI) was constructed by String website. Finally, RGUI software was used to complete GO function and KEGG pathway enrichment analysis of the targets.Ten active components of Equiseti Hiemalis Herba and 2 active components of Celosiae Semen were screened out, including β-sitosterol, a common component of both herbs. In addition, 295 targets related with Equiseti Hiemalis Herba, 88 targets related with Celosiae Semen, 2702 target genes related with DR, and 134 disease-drug intersection targets were obtained. JUN, MAPK1, RELA, AKT1, and TNF were core targets of PPI network. GO enrichment analysis found that the cell component where the targets were located was mainly the membrane area, the biological process was mainly enriched in the lipopolysaccharide response and oxidative stress response, and the molecular function was mainly to regulate cytokine activity and regulate cytokine receptor binding. KEGG enrichment analysis found that the glycation end products pathway was the core pathway.The mechanism of Equiseti Hiemalis Herba - Celosiae Semen pair for DR involves a variety of complex biological processes, and the main target is concentrated in the AGE→RAGE pathway mediated by advanced glycosylation end products in the membrane area, targeting many pathological processes such as inflammation, necrosis, and proliferation of retinal blood vessels.

Equiseti Hiemalis Herba; Celosiae Semen; diabetic retinopathy; network pharmacology

R259.872；R285.5

A

1005-5304(2021)02-0028-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005585

國家自然科學基金（81603401、81873181、81473367）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金（Z0659、Z0647）；北京市科技計劃（Z121100000312006）

顧浩，E-mail：hebegu@126.com

（收稿日期：2020-05-28）

（修回日期：2020-08-03；編輯：陳靜）