蘇琪皓，任麗梅，姜鳳霞，武金寶，江振宇

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝損傷的愈合反應(yīng)，是由各種急慢性損傷引起肝細(xì)胞變性、壞死或凋亡，進(jìn)而激活多種炎癥相關(guān)因子的釋放，啟動各種炎癥信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化的結(jié)果[1,2]。在HSCs被激活過程中伴隨著α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)高表達(dá)，同時分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分，以I型膠原蛋白(type I collagen)和III型膠原蛋白(type III collagen)為主[3,4]。長期臨床實(shí)踐證明中蒙藥具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多層次作用的優(yōu)點(diǎn)，在防治HF中取得了較好的療效[5-7]，在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷具有抗纖維化作用[8]。內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥額力根II號是重組方劑，經(jīng)過中蒙醫(yī)人員長期臨床觀察，發(fā)現(xiàn)其具有清肝熱、解毒、調(diào)理三根、養(yǎng)胃和肝之功效。本實(shí)驗(yàn)通過建立穩(wěn)定的CCl4大鼠HF模型，給予不同劑量的額力根II號水煎液灌胃，探討了其干預(yù)HF的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑與儀器 58只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量為170±10 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部【許可證號為SCXK(京)2010-0002】。額力根II號【由金石榴10 g，柯子、梔子、川楝子、西紅花、扁蕾、紫檀香、丁香、黨參、丹參、黃芪、木香、柴胡、五味子、五靈脂(制)、草果仁、寒水石各5 g，冬蟲夏草1 g，人工牛黃2 g組成，經(jīng)包頭市蒙中醫(yī)院姜鳳霞主任醫(yī)師鑒定，由包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中藥房提供】。將額力根II號1付溶于純凈水200 ml，90℃水浴鍋煮沸1 h，經(jīng)沙布過濾，得到過濾液；重復(fù)上述步驟2次，最后將所有的過濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至50 ml，于4℃冰箱保存。CCl4購于棗莊水嵐泰化工有限公司，抗α-SMA購于Leica公司，抗Collagen I購于Abcam公司，抗Collagen III購于Cellsignal公司，二抗等為Leica novocastra NovoLink聚合物檢測系統(tǒng)RE7280-K檢測試劑盒，蘇木素購于福州邁新公司，Masson為廣州維格斯特染試劑盒，血清肝功能試劑盒為寧波美康試劑盒，檢測血清肝纖維化指標(biāo)試劑盒購于北京北方生物技術(shù)有限公司，全自動生化分析儀為東芝TB120全自動生化分析儀，放射免疫分析儀為SN-697全自動雙探頭放射免疫γ計(jì)數(shù)器。

1.2 模型的制備 將SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為對照組10只和模型組、小劑量組、中劑量組和大劑量額力根II號處理組(各12只)。將CCl4和橄欖油混合，配制成40% CCl4橄欖油溶液。在對照組，給予生理鹽水3 ml.kg-1皮下注射，在其余各組，給予40% CCl4橄欖油溶液3 ml.kg-1腹部皮下注射，首劑加倍，2次/w，持續(xù)8 w[9]；自造模第4 w開始，各給藥組分別給予額力根II號水煎液2.0 g.kg-1、4.0 g.kg-1和8.0 g.kg-1灌胃，對照組和模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)給藥5 w。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，模型組、中劑量組和大劑量組各有3只大鼠死亡，小劑量組有2只大鼠死亡。在末次給藥后禁食不禁水，24 h后給予10% 水合氯醛3 ml.kg-1腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈采血，分離血清；從距離肝門部2.0 cm處切取肝組織，置于4% 多聚甲醛溶液中固定，切片，行HE和Masson染色，參考Ishak評分系統(tǒng)[10]行HF評分。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測肝組織α-SMA、Collagen I和Collagen III表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組血生化指標(biāo)比較 見表1。

表1 各組大鼠血生化指標(biāo)比較

2.2 各組血清肝纖維化指標(biāo)比較 見表2。

表2 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)(比較

表2 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)(比較

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

只數(shù)HA(μg/L)CⅣ(μg/L)LN(μg/L)PⅢNP(μg/L)對照組1089.2±11.321.4±2.321.6±3.51.9±0.4模型組9270.9±14.6①89.4±14.4①74.7±14.4①5.8±1.4①小劑量組10259.8±24.7①88.0±12.6①70.8±22.5①5.2±0.5①中劑量組9189.7±20.2①②80.1±26.7①67.4±15.3①5.2±0.7①大劑量組9152.4±17.5①②50.1±14.4①②65.8±14.7①4.9±0.3①②

2.3 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 見圖1。在對照組，在匯管區(qū)可見肝細(xì)胞少量表達(dá)α-SMA和膠原蛋白；在模型組，在纖維化區(qū)域可見α-SMA和膠原廣泛高表達(dá)；在藥物干預(yù)組，在肝纖維化區(qū)域炎細(xì)胞顯著減少，α-SMA和膠原蛋白表達(dá)顯著減弱(圖2、圖3、表3)。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(Masson，40×)

圖2 各組大鼠肝組織I型膠原表達(dá)(免疫組化，40×)

圖3 各組大鼠肝組織III型膠原表達(dá)(免疫組化，40×)

表3 各組大鼠肝組織蛋白表達(dá)比較

3 討論

肝臟長期受到各種有害因素的刺激后形成難以修復(fù)的損傷，即HF的形成，繼續(xù)發(fā)展可形成肝硬化，進(jìn)一步導(dǎo)致門脈高壓、肝衰竭、肝性腦病、肝細(xì)胞癌等一系列并發(fā)癥[11]。研究顯示HF的過程是可逆的，早期藥物干預(yù)可延緩或阻止各種慢性肝病的進(jìn)展，降低肝硬化的發(fā)生率[12,13]，故研究治療HF的藥物勢在必行。

本實(shí)驗(yàn)在模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平顯著升高，可能由于CCl4是一種典型的肝臟化學(xué)性毒物，長期、多次皮下注射進(jìn)入肝細(xì)胞，經(jīng)肝細(xì)胞p450酶途徑代謝產(chǎn)生大量的CCl3自由基等活性代謝物，使細(xì)胞或組織所處的氧化還原穩(wěn)態(tài)環(huán)境被破壞，抗氧化酶的活性降低，同時這些活性代謝物攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子，啟動脂質(zhì)過氧化的作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死[14,15]，肝細(xì)胞膜通透性增加甚至破裂，胞漿和線粒體內(nèi)的ALT和AST釋放出來，同時肝損傷會發(fā)生膽紅素代謝紊亂，故血清TBIL相應(yīng)升高[16]。模型組肝組織可見大量的纖維間隔和假小葉形成，膠原增加，LN、HA、PIIINP、CIV水平顯著升高，證明建立了穩(wěn)定的HF模型。相關(guān)文獻(xiàn)研究顯示血清ALT、AST和TBIL的活性與肝損傷程度呈一致性[17]，LN、HA、PIIINP、CIV水平與HF病變程度呈現(xiàn)一致性[18]。本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)研究報(bào)道相符合。經(jīng)過額力根II號治療后，大、中劑量組不同程度的減輕了肝損傷，降低了血清ALT、AST、TBIL、HA、PIIINP、CIV水平，肝組織病理學(xué)改變呈緩解趨勢，且與藥物劑量有依賴關(guān)系。由此表明中、大劑量的額力根II號對HF有一定的保護(hù)作用，但是關(guān)于其抑制了一條還是多條炎癥傳導(dǎo)通路有待進(jìn)一步研究。

在正常情況下，肝組織HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，表達(dá)α-SMA非常少。α-SMA作為HSCs的標(biāo)志物，其表達(dá)程度越高代表HSCs活化越顯著。本實(shí)驗(yàn)在模型組肝組織α-SMA、Collagen I和Collagen III表達(dá)增強(qiáng)，主要由于肝臟受到CCl4損傷后產(chǎn)生的各種炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)HSCs活化，有大量的α-SMA表達(dá)，在活化過程中分泌大量的ECM，導(dǎo)致ECM合成與降解失去平衡[19,20]，故模型組肝組織α-SMA、Collagen I、Collagen III表達(dá)顯著增強(qiáng)。經(jīng)過藥物干預(yù)后，在中、大劑量藥物干預(yù)組，肝組織α-SMA、Collagen I和Collagen III表達(dá)減弱，而且α-SMA表達(dá)變化趨勢與Collagen I和Collagen III同步，主要分布在匯管區(qū)，說明額力根II號可抑制HSCs激活，使α-SMA的表達(dá)降低，減少了ECM中Collagen I和Collagen III的表達(dá)，減少了膠原沉積，發(fā)揮了抗纖維化的作用，但是關(guān)于其抑制HSCs的活化機(jī)制需體外培養(yǎng)HSCs進(jìn)一步驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)存在以下不足：1)與模型組相比較，中、大劑量藥物干預(yù)組大鼠血清LN水平和部分肝功能指標(biāo)無顯著改變，可能與樣本量小或者大鼠的自身差異等因素有關(guān)，故在以后研究中需擴(kuò)大樣本量或開展多中心研究，盡量減少誤差；2)本實(shí)驗(yàn)研究顯示額力根II號具有抗纖維化的作用，但是未對額力根II號藥物的副作用、不良反應(yīng)等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測，故關(guān)于藥物的安全性、副作用等方面需要后續(xù)深入研究；3)HF的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，是肝損傷后的機(jī)體整體參與的修復(fù)反應(yīng)，涉及多個炎癥介質(zhì)的參與，故以后應(yīng)深入進(jìn)行基礎(chǔ)研究，比如采用PCR、蛋白質(zhì)印跡法和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)多層次、多角度從藥劑、藥理、動物模型、細(xì)胞分子水平等水平研究藥物的作用機(jī)制，完整、清晰地表述其抗纖維化的作用機(jī)理。

蒙藥額力根II號對CCl4誘導(dǎo)的HF大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制了HSCs活化，減少了ECM的合成有關(guān)。