都慶國，陸建文，王建華，龍延濱，薛 飛

肝纖維化(liver fibrosis，LF)是病毒、藥物、炎癥、脂肪沉積等病因刺激下發(fā)生的可逆性的肝臟損傷修復(fù)反應(yīng)，其本質(zhì)是肝臟損傷后細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的沉積過程，導(dǎo)致有功能的肝臟實(shí)質(zhì)被瘢痕組織所替代，并且刺激肌纖維母細(xì)胞增殖活化，進(jìn)一步產(chǎn)生大量的膠原蛋白和未折疊蛋白質(zhì)[1-3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)作為真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器，主要參與蛋白質(zhì)的合成、加工、修飾、折疊、運(yùn)輸?shù)纫幌盗猩飳W(xué)過程。當(dāng)大量的膠原蛋白產(chǎn)生時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)啟動應(yīng)激機(jī)制，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反應(yīng)，以促進(jìn)細(xì)胞存活。但若應(yīng)激持續(xù)存在，細(xì)胞將啟動凋亡程序，并加速肝纖維化的發(fā)生。因此，通過抑制ERS反應(yīng)減輕肝臟損傷，控制細(xì)胞凋亡是延緩肝纖維化進(jìn)展的重要途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，生長抑素(somatostatin，SST)可以通過減輕肝臟炎癥降低肝酶、減輕肝損傷，但是關(guān)于SST是否能夠通過減輕肝臟損傷抑制ERS反應(yīng)，并進(jìn)一步減緩LF形成，未見相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)小鼠LF動物模型，觀察了SST對ERS和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以探討SST是否能通過抑制ERS反應(yīng)減輕肝臟損傷，控制LF進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 40只10周齡健康野生型C57BL/6小鼠，雌雄不限，體質(zhì)量(25±3)g，購于上海必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司。CCl4、oil、二甲苯、75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、天狼星紅染色液、PBS均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；注射用SST由瑞士默克雪蘭諾公司生產(chǎn)；抗I型膠原(collagen I)購于Southern Biotech；抗Bcl-2、抗Bax、抗CHOP購于Santa Cruz；抗BiP、抗Caspase-9(Casp-9)、抗HSC70抗體購于Abcam；二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。蛋白裂解液(RIPA)、蛋白酶抑制劑(PI)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、ECL-化學(xué)發(fā)光試劑盒、蛋白上樣緩沖液、BSA、DAB顯色液購自上海碧云天公司。

1.2 LF動物模型的建立 將40只小鼠隨機(jī)分為對照組(oil)、模型組(CCl4)、小劑量SST干預(yù)組(CCl4+SST-L)和大劑量SST干預(yù)組(CCl4+SST-H)，每組10只。除對照組外，給予其余各組小鼠25% CCl4橄欖油混合液10μl.g-1腹腔注射，2次/w；在干預(yù)組，分別給予SST 10 μg.kg-1和20 μg.kg-1皮下注射，2次/d；在對照組和模型組，給予等量生理鹽水皮下注射。造模觀察8 w后，處死動物，取血1 mL，離心取上清、凍存。取小鼠肝臟，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，將余肝組織液氮凍存。石蠟切片行天狼猩紅染色和免疫組化染色。在10倍和20倍鏡下，隨機(jī)選擇每張切片5個(gè)視野。根據(jù)Ishak評分分析肝組織纖維化和膠原蛋白含量。按炎性改變程度，給予對應(yīng)的評分：碎屑樣壞死(0～4分)；融合性壞死(0～6分)；點(diǎn)狀壞死(0～4分)；匯管區(qū)炎癥(0～4分)。根據(jù)肝纖維組織沉積程度，給予對應(yīng)的評分(0～6分)。

1.3 血清肝功能檢測 測定血清AST和ALT水平。

1.4 肝組織蛋白表達(dá)檢測 取約20 mg凍存肝組織，充分碾磨裂解，4℃下14000 r/m離心20 min，收集上清液。用BCA試劑盒測定蛋白濃度。按Western blot操作流程進(jìn)行檢測，應(yīng)用Image-J軟件分析Bcl-2、Bax、Casp-9、BiP、CHOP和HSC70各條帶灰度值。以HSC70作為內(nèi)參，對各目的蛋白相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 對照組肝細(xì)胞條索結(jié)構(gòu)正常，少見炎性細(xì)胞，極少膠原纖維分布于匯管區(qū)周圍，未見纖維沉積；模型組可見肝細(xì)胞排列紊亂，炎性細(xì)胞大量浸潤，粗大纖維條索明顯沉積，膠原纖維大量產(chǎn)生，形成纖維間隔圍繞在匯管區(qū)和血管周圍，假小葉形成；SST干預(yù)組多數(shù)肝細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)較為清晰，炎性細(xì)胞浸潤較輕，但仍可見膠原纖維沉積，穿梭于匯管區(qū)和血管周圍，程度較輕(圖1)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) (A：天狼猩紅染色，100×；B：免疫組化染色，200×，黑色箭頭所示為I型膠原纖維)

2.2 各組肝組織Ishak評分比較 與對照組比，模型組肝組織纖維化和炎性活動明顯增高，膠原蛋白沉積顯著(P<0.01)；SST干預(yù)組肝組織纖維化和炎性活動程度下降，顯著低于模型組(P<0.05)，而兩SST處理組間無顯著差異(表1、表2)。

表1 各組小鼠肝組織炎癥活動度Ishak評分比較

表2 各組小鼠肝纖維化沉積程度Ishak評分比較

2.3 各組血清肝酶水平比較 模型組血清AST和ALT水平顯著高于對照組(P<0.01)；SST干預(yù)組血清AST和ALT水平顯著低于模型組(P<0.05，表3)。

表3 各組小鼠血生化指標(biāo)比較

2.4 各組肝組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 模型組促凋亡蛋白Bax和Casp-9相對表達(dá)量顯著強(qiáng)于對照組(P<0.001)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2相對表達(dá)量顯著弱于對照組(P<0.01)；SST干預(yù)組肝組織Bax和Casp-9蛋白相對表達(dá)量顯著弱于模型組(P<0.05)，而Bcl-2蛋白相對表達(dá)量未見明顯改變(圖2)。

*** P<0.001，** P<0.01，* P<0.05

2.5 各組肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對照組比，模型組BiP和CHOP蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；SST干預(yù)組肝組織BiP和CHOP蛋白表達(dá)水平較模型組顯著下降(P<0.05，圖3)。

*** P<0.001

3 討論

肝纖維化是各種急慢性肝損傷導(dǎo)致的肝纖維化生成和炎癥反應(yīng)的過程[4-8]。如不及時(shí)處理可能進(jìn)展成為肝硬化甚至肝癌。在肝纖維化進(jìn)程中，多種肝內(nèi)細(xì)胞被活化，伴隨產(chǎn)生大量的炎癥因子和趨化因子，如膠原蛋白、α平滑肌肌動蛋白、波形蛋白等纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白的過表達(dá)，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。有研究表明，ECM的分泌和沉積會激發(fā)ERS。在輕度細(xì)胞炎癥反應(yīng)時(shí)，ERS可通過提高蛋白質(zhì)代謝能力使細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)[9-12]。當(dāng)慢性持續(xù)性刺激存在時(shí)，ERS則通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加速肝纖維化的進(jìn)展。因此，通過減輕肝臟細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制ERS過度激活，對減緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化形成具有重要的意義[13-15]。

SST是一種廣泛存在于胃腸道、腦、內(nèi)外分泌腺等組織的環(huán)狀多肽類激素[16-18]。研究證實(shí)，SST能夠抑制免疫過度激活，減輕炎癥反應(yīng)，具有細(xì)胞保護(hù)作用。但其是否參與調(diào)節(jié)ERS，并進(jìn)一步調(diào)控肝纖維化形成目前未見報(bào)道。

在本研究，我們首先建立了小鼠LF動物模型，病理學(xué)檢查見CCl4可誘導(dǎo)膠原和纖維沉積，肝細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤明顯。血清AST和ALT明顯升高。肝組織Ishak評分顯示肝臟炎癥活動度和纖維化表現(xiàn)明顯，說明CCl4成功誘導(dǎo)了LF的形成，并伴有嚴(yán)重肝臟炎癥性改變。給予SST干預(yù)后，肝組織病理學(xué)改變明顯減輕，肝功能和纖維化程度明顯減輕，說明SST對肝臟炎癥反應(yīng)及其導(dǎo)致的肝纖維化程度有改善作用。

我們進(jìn)一步探究了SST是否參與調(diào)解ERS。通過對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Casp-9表達(dá)檢測，發(fā)現(xiàn)CCl4能夠?qū)е麓俚蛲龅鞍譈ax和Casp-9表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，ERS相關(guān)蛋白BiP和CHOP表達(dá)顯著增加，說明CCl4激活ERS反應(yīng)并導(dǎo)致細(xì)胞大量凋亡。給予SST干預(yù)后，肝組織Bax和Casp-9蛋白表達(dá)顯著下降，BiP和CHOP蛋白水平明顯降低，說明SST可以抑制纖維化小鼠肝組織ERS，減輕細(xì)胞凋亡程度[19,20]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明SST能夠通過改善肝臟炎癥狀態(tài)，抑制ERS，從而減輕肝臟損傷，抑制細(xì)胞凋亡，最終達(dá)到改善LF的目的。本研究為LF的防治提供了新的理論依據(jù)，但ERS涉及的通路較多，關(guān)于SST具體影響哪條通路還有待進(jìn)一步深入研究。