藺小兵，汪 豪，張鈞涵，林子豪，嚴(yán) 明*，安曉飛

（1中國(guó)藥科大學(xué)新藥篩選中心，南京210009；2中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室，南京210009；3南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南京210029）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種具有高發(fā)病率和高致殘率的自身免疫性疾病，能夠引起軟骨基質(zhì)和骨質(zhì)破壞［1］。目前RA 臨床治療藥物主要包括非甾體抗炎藥（NSAIDs）、抗風(fēng)濕藥（如甲氨蝶呤）、糖皮質(zhì)激素和生物制劑等，但部分患者對(duì)上述藥物具有抗藥性或藥物長(zhǎng)期服用具有胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)［2］。同時(shí)，RA 治療藥物還包括靶向TNF 和IL-6 的單克隆抗體（mAb）在內(nèi)的生物制劑可顯著改善關(guān)節(jié)炎和骨破壞。但仍然有大約50%的患者對(duì)生物制劑沒有反應(yīng)，并且這些藥物可能會(huì)增加嚴(yán)重感染的風(fēng)險(xiǎn)［3-4］。

據(jù)報(bào)道，涉及RA 的多種靶點(diǎn)中，前列腺素E2受體4（EP4）是最有潛力的，和其他阻斷前列腺素合成的NSAIDs不一樣的是，EP4拮抗劑具有免疫調(diào)節(jié)和直接抗炎活性［5］。研究發(fā)現(xiàn)EP4信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的IL-23合成及其從周圍組織到引流淋巴結(jié)的趨化性，是引發(fā)T 細(xì)胞的關(guān)鍵步驟［6］。重要的是，PGE2-EP4 相互作用促進(jìn)T 型輔助1 型（Th1）淋巴細(xì)胞分化和Th17 增殖。EP4 通常也表達(dá)于關(guān)節(jié)細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞。EP4信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)破骨細(xì)胞的形成和活化，主要參與RA 的骨吸收，且PGE2 加劇了小鼠的膠原性關(guān)節(jié)炎［5，7］。另外，EP4敲除小鼠可以抵制膠原性關(guān)節(jié)炎，并且臨床、病理學(xué)和細(xì)胞標(biāo)志物均下降［8］。臨床試驗(yàn)報(bào)道EP4 拮抗劑CR6086 是一種潛在的抗類風(fēng)濕藥（https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/results/NCT03163966），具有免疫調(diào)節(jié)和抗類風(fēng)濕活性［9］。這些說明EP4拮抗劑對(duì)RA治療具有重要意義，故本研究旨在從崗松活性成分中篩選用于RA治療的EP4拮抗劑。

崗松（Baeckea frutescensL.）屬桃金娘科，是一種傳統(tǒng)中草藥，民間常用于治療發(fā)熱、婦女經(jīng)閉、產(chǎn)后婦女肢體酸痛及類風(fēng)濕性疾病等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)崗松含有豐富的揮發(fā)油、黃酮類和間苯三酚類化合物，并且具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗炎、抑菌、抗病毒和抗腫瘤活性［10］。本課題組之前從崗松醇提取物中分離得到了一系列有效活性成分，主要包括間苯三酚類、黃酮類等，并發(fā)現(xiàn)了具有一系列體外具有抗炎活性的化合物，如BF-2（Baeckein E）、Frutescone O 等［6，11-14］。雖然，之前已經(jīng)篩選了崗松的抗炎化合物，但體內(nèi)活性和機(jī)制研究較少，故本研究從崗松中篩選了EP4 拮抗劑和探討了體內(nèi)抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性，以便發(fā)現(xiàn)用于治療RA的新型EP4拮抗劑。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

崗松化合物樣品均由中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室汪豪教授提供（純度≥95%）。按照之前文獻(xiàn)報(bào)道［6，11-14］，從崗松地上部分中提取并分離一系列化合物。簡(jiǎn)述如下：用95%乙醇回流萃取崗松地上部分（1 kg）2 h，然后減壓濃縮提取物。將30 g 殘留物重懸于水中，并用石油醚分配，收集石油醚部分。濃縮蒸發(fā)收集崗松醇提取物（8.0 g）。最后，硅膠柱色譜柱分離洗脫得到一系列崗松化合 物（BF-ext，BF-2，BF-11，BF-13，BF-18，BF-25，BF-32，BF-19，BF-1，BF-20，BF-12，BF-15，BF-22，BF-48 和BF-45），采用HPLC-UV 鑒定化合物純度。BF-2 化合物結(jié)構(gòu)式見圖1。cAMP-d2 試劑盒（貨號(hào)：62AM9PEB，法國(guó)Cisbio 公司）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX，法國(guó)Cisbio 公司）；PGD2（EP4 激動(dòng)劑）和L-161982（EP4 拮抗劑，上海MCE 公司）；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（碧云天生物科技有限公司）；阿司匹林、甲氨蝶呤（阿拉丁生化科技股份有限公司）；雞Ⅱ型膠原（大連美倫生物技術(shù)有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMCNa，上海生工生物股份有限公司）。

Figure 1 Structure of BF-2(Baeckein E,C30H34O7)from Baeckea frutescens L.

1.2 儀 器

Envision 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkin Elmer公司）。

1.3 細(xì) 胞

HEK293T-EP4 細(xì)胞（HEK293T 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)EP4）購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司（南京）。

1.4 動(dòng) 物

SPF 級(jí)別ICR 小鼠，雄性，體重19～25 g，55 只，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，合格證編號(hào)：No.201832838，實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2018-0019。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293T-EP4細(xì)胞用含10%FBS+1%雙抗（青霉素和鏈霉素）+G418（0.5 mg/mL）的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，待生長(zhǎng)至80%～90%，用0.25%EDTA消化細(xì)胞傳代。

2.2 篩選模型

根據(jù)cAMP-d2 試劑盒說明書采用384 微孔板建立篩選模型。

最佳細(xì)胞數(shù)確定：將HEK293T-EP4 細(xì)胞濃度依次用刺激緩沖液（SB溶液）（含1 mmol/L IBMX的DMEM 培養(yǎng)基）將細(xì)胞梯度稀釋為每毫升2×105、4 × 105和8 × 105個(gè)細(xì)胞，每孔5 μL，將Forsklin 梯度稀釋，第1 個(gè)最終反應(yīng)濃度為100 μmol/L，每孔5 μL，將384 孔板500 r/min 離心15 s，室溫孵育45 min，隨后加入cAMP-d2和Anti-cAMP混合液（裂解緩沖液稀釋）終止反應(yīng)，室溫繼續(xù)孵育60 min，待孵育結(jié)束后，使用多功能酶標(biāo)儀于665 nm/615 nm處檢測(cè)信號(hào)，計(jì)算EC80和信噪比S/B。

激動(dòng)劑模型：使用上述最佳細(xì)胞數(shù)及對(duì)應(yīng)的Forsklin EC80進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，用FSB（含EC80Forsklin 的SB 溶 液）將EP4 激 動(dòng) 劑PGD2梯 度 稀釋，第1 個(gè)最終反應(yīng)濃度為50 μmol/L，每孔5 μL，將細(xì)胞稀釋至最佳細(xì)胞數(shù)，每孔5 μL，將384 孔板500 r/min 離心15 s，室溫孵育45 min，隨后加入cAMP-d2 和Anti-cAMP 混合液（裂解緩沖液稀釋）終止反應(yīng)，室溫繼續(xù)孵育60 min，待孵育結(jié)束后，使用多功能酶標(biāo)儀于665 nm/615 nm 處檢測(cè)信號(hào)，計(jì)算EC80。

拮抗劑模型：采用FSB溶液梯度稀釋L-161982（EP4拮抗劑），第1個(gè)最終反應(yīng)濃度為100 μmol/L，每孔2.5 μL，與5 μL 細(xì)胞混合于室溫反應(yīng)30 min。根據(jù)上述激動(dòng)劑模型實(shí)驗(yàn)EC80配制含PGD2的FSB溶液，每孔2.5 μL，加入384 孔板，反應(yīng)45 min，隨后加入cAMP-d2和Anti-cAMP混合液（裂解緩沖液稀釋）終止反應(yīng)，室溫繼續(xù)孵育60 min，待孵育結(jié)束后，使用多功能酶標(biāo)儀于665 nm/615 nm 處檢測(cè)信號(hào)，計(jì)算IC50。

2.3 化合物初篩

使用上述建立的EP4 拮抗劑細(xì)胞模型從崗松提取物（BF-ext，BF-2，BF-11，BF-13，BF-18，BF-25，BF-32，BF-19，BF-1，BF-20，BF-12，BF-15，BF-22，BF-48 和BF-45）中篩選EP4 拮抗劑，用FSB 溶液稀釋化合物（最終反應(yīng)濃度為100 μg/mL），0.1%DMSO作為陰性對(duì)照，L-161982作為陽(yáng)性對(duì)照，每孔2.5 μL，與細(xì)胞懸液5 μL 混合于室溫反應(yīng)30 min，加入PGD2繼續(xù)反應(yīng)45 min，隨后加入cAMP-d2 和Anti-cAMP 混合液（裂解緩沖液稀釋）終止反應(yīng)，室溫繼續(xù)孵育60 min，待孵育結(jié)束后，使用多功能酶標(biāo)儀于665 nm/615 nm 處檢測(cè)信號(hào)，計(jì)算化合物抑制率。

2.4 化合物復(fù)篩

初篩實(shí)驗(yàn)中抑制率達(dá)60%以上的化合物進(jìn)行后續(xù)的復(fù)篩，將化合物用FSB 溶液梯度稀釋8個(gè)濃度，第1個(gè)最終反應(yīng)濃度為100 μg/mL，每孔2.5 μL，與5 μL 細(xì)胞混合于室溫反應(yīng)30 min，加入PGD2繼續(xù)反應(yīng)45 min，隨后加入cAMP-d2 和Anti-cAMP混合液（裂解緩沖液稀釋）終止反應(yīng)，室溫繼續(xù)孵育60 min，待孵育結(jié)束后，使用多功能酶標(biāo)儀于665 nm/615 nm處檢測(cè)信號(hào)，計(jì)算化合物IC50。

2.5 膠原誘導(dǎo)型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型（CIA）

使用ICR小鼠，尾巴根部皮下注射完全弗氏佐劑（含Ⅱ型膠原，2 mg/mL）免疫誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，對(duì)照組僅注射生理鹽水，其他各組注射含Ⅱ型膠原的完全弗氏佐劑，體積均為100 μL，分別在第1 次免疫后7 和21 d，注射含Ⅱ型膠原的不完全弗氏佐劑（1∶1）進(jìn)行二次免疫。選擇3 點(diǎn)注射，左后足底、尾根部及背部皮內(nèi)注射共計(jì)100 μL。

2.6 動(dòng)物分組及給藥方法

分對(duì)照組、模型組（Model）、甲氨蝶呤（MTX，1 mg/kg）、崗松提取物BF-2（100、50 和25 mg/kg）組，每組5 只。在第1 次免疫后22 d，開始給藥，每天1 次，連續(xù)給藥8 d，對(duì)照組及模型組給予等體積的CMC-Na。

2.7 足趾腫脹測(cè)量

排水法：首先在每只小鼠的關(guān)節(jié)處做一標(biāo)記，其次向內(nèi)徑2 cm 的20 mL 注射器注入純凈水，液面與量筒最高刻度平齊。用最小刻度為0.1 mL的1 mL 注射用針管吸取注射器內(nèi)的純凈水約1 mL。再把小鼠足跖緩緩伸入注射器內(nèi)，使標(biāo)記與注射器最高刻度平齊。再用已吸入水1 mL的針管向注射器內(nèi)慢慢注入水液，使液面再次與最高刻度及標(biāo)記平齊。從1 mL注射器上的刻度處讀出其內(nèi)部剩余液體體積，即為小鼠的足趾體積，重復(fù)2 次取其均值。

2.8 病理組織學(xué)檢測(cè)

小鼠脫頸椎處死，剔除小鼠踝關(guān)節(jié)及足趾的皮毛和肌肉，將踝關(guān)節(jié)及足趾置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后放于10% EDTA 脫鈣液（pH 8.0），脫鈣15 d，每3 天換一次液，然后用石蠟包埋，切成5 μm 矢狀切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，用顯微鏡觀察關(guān)節(jié)組織的病理形態(tài)。

2.9 體內(nèi)鎮(zhèn)痛活性

將ICR 小鼠分為對(duì)照組、阿司匹林（200 mg/kg）和崗松提取物BF-2（100、50 和25 mg/kg）組，每組5 只，每天1 次，連續(xù)灌胃8 d，最后一次給藥后30 min，腹腔注射1.0%冰醋酸0.2 mL，記錄15 min內(nèi)的小鼠扭體次數(shù)。

2.10 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 8.0 軟件分析，結(jié)果表示為，體外數(shù)據(jù)用非線性回歸分析計(jì)算EC50和IC50以及EC80。體內(nèi)數(shù)據(jù)用One-Way ANOVA 和Two-Way ANOVA 進(jìn)行多組數(shù)據(jù)的檢驗(yàn)，Area Under Curve 進(jìn)行曲線下面積計(jì)算，以P ＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié) 果

3.1 EP4拮抗劑篩選模型建立

首先確定了EP4 拮抗劑活性檢測(cè)的條件，以不同濃度的Forskolin 刺激細(xì)胞，結(jié)果表明細(xì)胞數(shù)為每孔4 000 個(gè)細(xì)胞時(shí)，所得信噪比（S/B）最大，且Forskolin EC80為（540.7±63.29）nmol/L（圖2-A 和圖2-B）；采用上述條件驗(yàn)證了PGD2對(duì)EP4 受體的激動(dòng)活性，其EC50為（8.00±0.53）μmol/L（圖2-C）；采用上述條件檢測(cè)陽(yáng)性藥L-161982 對(duì)EP4 的拮抗劑活性，結(jié)果表明其IC50為（0.49 ± 0.02）μmol/L（圖2-D）。

3.2 EP4拮抗劑活性化合物初篩

初 篩 表 明，BF-2、BF-20、BF-11 和BF-12 對(duì)EP4 受體具有較強(qiáng)拮抗活性，其抑制率分別為（102.11 ± 3.45）%、（90.31 ± 3.59）%、（75.72 ±1.79）%和（76.84±1.64）%，見表1。

3.3 EP4拮抗劑活性化合物復(fù)篩

復(fù)篩表明，BF-2和BF-20對(duì)EP4受體的拮抗活性具有量效關(guān)系，但BF-2 的拮抗活性較強(qiáng)，其IC50為（0.99±0.08）μg/mL，見圖3。

3.4 BF-2對(duì)CIA小鼠足趾體積的影響

與對(duì)照組小鼠相比，從第7 天開始，模型組小鼠足趾體積顯著增加，且一直持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；確定造模成功后，從第18 天開始灌胃給藥BF-2 和陽(yáng)性藥甲氨蝶呤（MTX），結(jié)果表明：與模型組相比，灌胃給予BF-2和MTX 組小鼠的足趾體積顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖4。

3.5 BF-2對(duì)CIA小鼠組織病理學(xué)的影響

Figure 2 Establishment of a cell-based 384-well HTRF-cAMP assay for EP4(,n = 3)

Table 1 Inhibition of compounds in preliminary screeningn = 3)

Table 1 Inhibition of compounds in preliminary screeningn = 3)

Compd.BF-ext BF-2 BF-11 BF-13 BF-18 BF-25 BF-32 BF-19 Inhibition/%45.75±1.97 102.11±3.45 75.72±1.79-47.1±1.48-50.37±1.48-62.48±8.15-34.07±2.07-92.59±12.59 Compd.BF-1 BF-20 BF-12 BF-15 BF-22 BF-48 BF-45 L-161982 Inhibition/%21.33±2.89 90.31±3.59 76.84±1.64-68.15±5.93-89.63±5.19-44.44±4.44-30.37±11.11 100.00±4.29

HE 染色結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠關(guān)節(jié)組織基質(zhì)均勻分布，關(guān)節(jié)腔無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠關(guān)節(jié)組織基質(zhì)損傷嚴(yán)重，且伴隨有部分增生，同時(shí)關(guān)節(jié)腔有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；BF-2（25 mg/kg）組小鼠關(guān)節(jié)組織基質(zhì)損傷稍有緩解，但基質(zhì)還存在大量壞死，并且關(guān)節(jié)腔有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；BF-2（50 mg/kg）組小鼠關(guān)節(jié)組織基質(zhì)排列比較均勻，但存在細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；BF-2（100 mg/kg）組小鼠關(guān)節(jié)組織基質(zhì)排列均勻，但關(guān)節(jié)腔有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；MTX 組小鼠關(guān)節(jié)組織基質(zhì)排列均勻，且同時(shí)關(guān)節(jié)腔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，見圖5（紅框：軟骨基質(zhì)；黃框：關(guān)節(jié)腔）。

3.6 BF-2對(duì)醋酸引起小鼠扭體次數(shù)的影響

對(duì)照組小鼠扭體次數(shù)為43 ± 4.3 次，BF-2 25 mg/kg 組 小 鼠 扭 體 次 數(shù) 為20 ± 5.0 次，BF-2 50 mg/kg 小鼠扭體次數(shù)為11 ± 4.6 次，BF-2 100 mg/kg組小鼠扭體次數(shù)為8±3.7次，阿司匹林組小鼠扭體次數(shù)為32±1.8次，這表明與對(duì)照組相比給予化合物BF-2和阿司匹林組小鼠的扭體次數(shù)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖6。

Figure 3 Dose-response curves representing EP4 cAMP responses to compounds which displayed EP4 inhibiting activityn = 3)

Figure 4 Effect of BF-2 on paw volume in CIA micen = 5)

Figure 5 Effect of BF-2 on joint pathology in CIA mice(n=5)

Figure 6 Effect of BF-2 on the number of writhing in acetic acid induced micen = 5）

4 討 論

在RA 發(fā)病機(jī)制涉及的多個(gè)靶標(biāo)中，前列腺素E2（PGE2）是最有希望的，因?yàn)樗c阻礙前列腺素合成的非甾體類抗炎藥（NSAIDs）不同，選擇性PGE2 受體拮抗劑具有將免疫調(diào)節(jié)劑和直接的抗炎 活 性 結(jié) 合 的 潛 力［15-16］。PGE2 受 體 主 要 包 括EP1、EP2、EP3和EP4。EP4主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞，可作為包括IL-1β 和IL-6 在內(nèi)促炎細(xì)胞因子的放大因子，EP4 拮抗劑可阻斷其活性［5，17-18］。另外，EP4信號(hào)是RA病理過程中骨吸收相關(guān)的主要參與者，因?yàn)榭梢栽鰪?qiáng)破骨細(xì)胞的形成和激活［7］。研究表明EP4 敲除小鼠對(duì)膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎發(fā)生與發(fā)展具有抗性，且組織病理學(xué)和細(xì)胞標(biāo)志物顯著下調(diào)［8］。因此，本研究首先采用EP4拮抗劑體外活性篩選模型從崗松中篩選了15 個(gè)EP4 拮抗劑，其中BF-2活性最強(qiáng)。后續(xù)采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究了BF-2的抗RA活性。

據(jù)報(bào)道，CIA 小鼠模型是RA 研究的常見模型之一，其被廣泛應(yīng)用于RA 的各種研究，以探索RA的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)RA 的治療靶點(diǎn)［9，17-21］。趙會(huì)勤等［22］研究表明崗松醇提取物能夠顯著緩解AIA 大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀并下調(diào)大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量。本課題前期也發(fā)現(xiàn)BF-2 能夠抑制MALP-2 刺激巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α 和一氧化氮（NO）等促炎介質(zhì)產(chǎn)生［13］。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)灌胃給予CIA 小鼠BF-2 能夠顯著緩解CIA 小鼠的足趾腫脹和潰爛，且能夠緩解醋酸引起的小鼠疼痛，對(duì)RA 具有潛在的治療價(jià)值。本研究推測(cè)BF-2抗RA 活性可能與抑制炎癥介質(zhì)有關(guān)，需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探究。滑膜炎和基質(zhì)破壞在RA 的病理過程中起著關(guān)鍵作用，與RA 的關(guān)節(jié)腫脹和疼痛密切相關(guān)［23］。大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)滑膜組織，引起各種促炎細(xì)胞因子和趨化因子及金屬基質(zhì)蛋白酶的釋放引起軟骨基質(zhì)損傷和破壞，加劇RA 發(fā)展［24-25］。本研究采用病理染色發(fā)現(xiàn)BF-2 可以緩解CIA 小鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)節(jié)腔及軟骨組織，并緩解軟骨基質(zhì)破壞。這些結(jié)果均表明BF-2 具有抗RA活性，并且與炎癥反應(yīng)和軟骨基質(zhì)保護(hù)有關(guān)。

綜上所述，本研究從崗松活性成分篩選得到了4 種EP4 拮抗劑，且BF-2 拮抗活性最強(qiáng)。更重要的是，發(fā)現(xiàn)BF-2 具有抗RA 活性，且與抑制炎癥反應(yīng)和軟骨基質(zhì)保護(hù)有關(guān)。但BF-2 抗RA 機(jī)制依然不清楚，需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步研究。