張瑞祺，張炎，趙金良*

(1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 2.水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306； 3.水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；4.上海工程技術(shù)大學(xué)，上海 201306)

視網(wǎng)膜作為魚類視覺系統(tǒng)中負(fù)責(zé)成像的重要結(jié)構(gòu)，與其生活習(xí)性與捕食習(xí)性息息相關(guān)[1-3]。視網(wǎng)膜主要依靠感光細(xì)胞層完成光線感知與目標(biāo)成像，感光細(xì)胞按其功能不同分為視桿細(xì)胞與視錐細(xì)胞，其中，視桿細(xì)胞主要負(fù)責(zé)暗視條件下感受弱光[3]，視錐細(xì)胞主要負(fù)責(zé)明視條件下的辨色與成像[1-2]。而根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，視錐細(xì)胞又分為單錐細(xì)胞、雙錐細(xì)胞和三錐細(xì)胞等亞型，其中雙錐細(xì)胞較為常見[1]。視桿細(xì)胞在視網(wǎng)膜中的結(jié)構(gòu)與數(shù)量直接決定了魚類視網(wǎng)膜感光能力的高低，即光敏度[1，4-5]；視錐細(xì)胞中含有吸光度不同的視蛋白，特定類型視錐細(xì)胞只對特定波長光照敏感，各類視錐細(xì)胞以不同數(shù)量與比例、排布進(jìn)行組合直接決定了魚類的辨色與成像能力，即視銳度[1，6-8]。

鱖Sinipercachuatsi是中國特有的名貴淡水經(jīng)濟(jì)魚類，自然條件下終身以活餌為食，白天隱藏在水底，常在晨昏時(shí)捕食魚類[9-11]。目前，已有學(xué)者對鱖捕食行為中視覺系統(tǒng)作用進(jìn)行了研究，如Liang等[10]利用行為學(xué)試驗(yàn)證明鱖捕食以視覺為主要感覺；鱖視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)方面已有不少研究，梁旭方[12]利用組織學(xué)方法對鱖視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)進(jìn)行了描述，指出其視網(wǎng)膜中含有大量視錐細(xì)胞，適宜感受弱光；魏開建等[13]、田文斐等[14]利用組織學(xué)方法對鱖視網(wǎng)膜早期發(fā)育特征進(jìn)行了描述，均發(fā)現(xiàn)鱖視網(wǎng)膜在發(fā)育階段視桿細(xì)胞、視雙錐細(xì)胞大量增長，并指出這種視覺結(jié)構(gòu)的變化與其從浮游到底棲的生態(tài)遷移及捕食方式的變化相適應(yīng)；Zhang等[15]對鱖視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，對其感光細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，鱖視桿細(xì)胞與視雙錐細(xì)胞結(jié)構(gòu)有利于鱖適應(yīng)暗光下的生活，但發(fā)育各階段視錐細(xì)胞排布規(guī)律較差可能導(dǎo)致其視銳度的下降；Zhang等[15]、魏開建等[13]均指出，在鱖稚魚到幼魚階段(D21～D56，其中下標(biāo)數(shù)值n代表出膜后的時(shí)間(d)，記作Dn)的短暫胚后發(fā)育時(shí)期中，鱖的視覺特點(diǎn)、生活習(xí)性均發(fā)生了顯著變化，由早期具有趨光性的主動攝食轉(zhuǎn)變?yōu)橼呄蛴诎倒庀律畹姆鼡粜筒妒?，這段特殊的發(fā)育時(shí)期被稱為鱖的視覺轉(zhuǎn)變期。

感光細(xì)胞是視覺結(jié)構(gòu)的主要組成，感光細(xì)胞的發(fā)育特點(diǎn)是分析魚類不同發(fā)育時(shí)期視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及視覺特點(diǎn)的重要內(nèi)容。目前，針對鱖視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層的發(fā)育與結(jié)構(gòu)變化的研究較少，有很多內(nèi)容尚待補(bǔ)充。首先，視桿細(xì)胞與視錐細(xì)胞在視網(wǎng)膜發(fā)育各時(shí)期的具體數(shù)量變化需要闡明，其次，對發(fā)育過程中各類感光細(xì)胞(視桿細(xì)胞、單錐細(xì)胞和雙錐細(xì)胞)在視網(wǎng)膜上的密度變化過程的研究尚未見報(bào)道，此外，鱖視網(wǎng)膜發(fā)育中大量出現(xiàn)的視桿細(xì)胞是否影響視錐細(xì)胞排布的規(guī)律性尚需進(jìn)行研究。利用組織學(xué)方法對鱖視網(wǎng)膜發(fā)育中感光細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)較為困難，主要表現(xiàn)為鱖視桿細(xì)胞外節(jié)細(xì)長且輪廓模糊，難以計(jì)數(shù)，而視單椎、雙椎細(xì)胞由于橢球體和外節(jié)部分限于觀察角度不同，易將二者混淆。本研究中，基于鱖視網(wǎng)膜明暗適應(yīng)時(shí)感光細(xì)胞層的結(jié)構(gòu)變化，利用免疫熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對視桿細(xì)胞的計(jì)數(shù)和單雙錐細(xì)胞的識別，對鱖視覺轉(zhuǎn)變期視桿細(xì)胞與視錐細(xì)胞的數(shù)目增長與分布特點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)的分析，同時(shí)對視桿細(xì)胞與視錐細(xì)胞排布構(gòu)建的相關(guān)性進(jìn)行了證明，旨在揭示鱖視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層的發(fā)育過程和特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究鱖適應(yīng)暗光下底棲生活提供重要資料。

1 材料與方法

1.1 材料

鱖Sinipercachuatsi魚苗取自上海市浦東新區(qū)孫農(nóng)水產(chǎn)養(yǎng)殖場。鱖視桿細(xì)胞與視雙錐細(xì)胞在D12～D14(體長為9.5～12.5 mm)零星出現(xiàn)，而視桿細(xì)胞與視雙錐細(xì)胞數(shù)量在D23(體長為20～25 mm)以后明顯升高，特別是D28(體長為25～35 mm)以后視桿細(xì)胞數(shù)量急劇上升，視雙錐細(xì)胞大量出現(xiàn)[13，15]，而至D56(體長為85～100 mm)以后視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)已與成魚結(jié)構(gòu)相仿[12-15]。為分析各類感光細(xì)胞的生長特點(diǎn)，驗(yàn)證視桿細(xì)胞數(shù)量上劇烈增加對視錐細(xì)胞排布構(gòu)建的影響，本試驗(yàn)中在鱖視覺轉(zhuǎn)變期均勻地選取3個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn) (D28、D42和D63)，采樣過程中確保所采樣本在每個(gè)特定發(fā)育階段的魚苗規(guī)格基本一致。視網(wǎng)膜光適應(yīng)采樣方法同Zhang等[15]，明適應(yīng)的鱖在自然光下直接取樣，暗適應(yīng)的鱖在無光條件下暗適應(yīng)5 h后采樣。

1.2 方法

1.2.1 視網(wǎng)膜組織切片 D28、D42和D63各時(shí)期選取規(guī)格一致的鱖魚苗5尾，浸入MS-222溶液中麻醉后選取鱖左眼角膜處正上方扎一小孔定位，將樣本頭部固定于2%多聚甲醛溶液48 h。用精密解剖剪將眼球取出，用1×PBS溶液漂洗，在體視鏡下用手術(shù)工具剝離多余組織，分離出完整視網(wǎng)膜組織。用梯度乙醇處理視網(wǎng)膜組織(25%→50%→75%→85%→95%，均為體積分?jǐn)?shù))，在各體積分?jǐn)?shù)的乙醇中均浸泡30 min，最后在體積分?jǐn)?shù)為100%的無水乙醇中浸泡1 min，取出后用二甲苯透明1 min，浸蠟3 h后包埋。利用Leica RM2235切片機(jī)以5 μm厚度做視網(wǎng)膜切向切片，用于后續(xù)H.E染色、免疫熒光觀察。

1.2.2 組織切片H.E染色 將“1.2.1節(jié)”中的視網(wǎng)膜組織切片置于二甲苯中脫蠟2次(15 min×2)，用梯度乙醇復(fù)水(100%→95%→85%→75%→50%，均為體積分?jǐn)?shù))，即在各體積分?jǐn)?shù)的乙醇中浸泡5 min后，將切片置于蒸餾水中5 min，蘇木精染液染15 min；水洗10 min，用體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸-乙醇浸泡后，蒸餾水沖洗，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5%的伊紅液染色1～3 min。再用梯度乙醇脫水，方法與復(fù)水時(shí)的操作相反，二甲苯處理后，用中性樹膠封片。

1.2.3 免疫熒光 緊密連蛋白(Zonula occluden-1，ZO-1)分布于細(xì)胞間貼合面，基于這一分布特征常利用轉(zhuǎn)基因或免疫熒光手段對其進(jìn)行熒光標(biāo)記，其熒光信號可以描繪細(xì)胞輪廓與細(xì)胞群體排列[16-17]；極性蛋白(Crumbs)在細(xì)胞的極性生長與穩(wěn)定細(xì)胞群體排列方面發(fā)揮重要作用[18]。本研究中，利用極性蛋白Crb2a (Crumbs家族蛋白成員之一)與緊密黏連蛋白ZO-1在細(xì)胞群體中分布的相似性與差異性，對視桿細(xì)胞計(jì)數(shù)及與視錐細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。具體操作如下：由“1.2.1節(jié)”所得組織切片在室溫下用二甲苯脫蠟(15 min×2)，梯度乙醇復(fù)水(體積分?jǐn)?shù)為100%～50%，每個(gè)步驟5 min)，磷酸鹽緩沖液漂洗(1×PBS，10 min×2)，PBTX (體積分?jǐn)?shù)0.1% tritonX-100，1×PBS稀釋)抗原修復(fù)，然后在室溫下用5%(體積分?jǐn)?shù))羊血清封閉1 h，4 ℃下一抗孵育過夜，使用的一抗和稀釋液詳見表1。按上述方法漂洗與封閉后，用二抗(體積分?jǐn)?shù)為5%的羊血清稀釋鼠抗IgGHRP 1∶1 000)孵育3 h，浸泡于PBTX中(1×PBS稀釋的Tween-20)，PBS漂洗后，用TSATM加雙熒光素標(biāo)記二級抗體(表1)，用TSA-F(1∶100，2 h)標(biāo)記鼠抗IgGHRP，按上述方法沖洗封閉，加入二級抗體(兔抗IgGHRP 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，用TSA-T(1∶100，2 h)標(biāo)記兔抗IgGHRP，PBS沖洗，梯度乙醇復(fù)水、封片。圖像采集使用尼康SMZ250熒光顯微鏡或徠卡SP5掃描共焦顯微鏡(Wetzlar，Germany)。

1.2.4 視網(wǎng)膜的光適應(yīng)與視桿細(xì)胞計(jì)數(shù) 在預(yù)試驗(yàn)中，有光條件下鱖視網(wǎng)膜中視錐細(xì)胞外段橢球體緊密地黏附在一起，并將視桿細(xì)胞擠壓在狹窄的間隙中，因此，較難對視桿細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和計(jì)數(shù)；相反，在暗適應(yīng)后，視網(wǎng)膜運(yùn)動發(fā)生，視錐細(xì)胞橢球體黏附強(qiáng)度逐漸減弱，視桿細(xì)胞分布在視錐細(xì)胞擴(kuò)大的間隙之間，從而在免疫熒光標(biāo)記的組織切片中可以清楚地識別視桿細(xì)胞，同時(shí)，也可對單錐與雙錐細(xì)胞進(jìn)行很好地識別(圖1(a)、(b))。此外，鱖視網(wǎng)膜胚后發(fā)育過程中視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞直徑并未出現(xiàn)顯著變化[15]。綜上，在暗適應(yīng)后對視網(wǎng)膜組織切片進(jìn)行免疫熒光處理后，使用Image J軟件對視網(wǎng)膜特定區(qū)域(100 μm2)的視桿細(xì)胞與視錐細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

藍(lán)色箭頭示視錐細(xì)胞橢球體結(jié)構(gòu)部分； 白色箭頭示雙錐細(xì)胞橢球體橫切面；綠色箭頭示單錐細(xì)胞橢球體橫切面。The blue arrow is the ellipsoid structure of the cone cell;The white arrow is the ellipsoid cross section of double cone cell；The green arrow is the ellipsoid cross section of single cone cell.圖1 明暗適應(yīng)下鱖視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)變化與免疫熒光效果Fig.1 Structural changes and the effect of immunofluorescence in retina of mandarinfish exposed to light and dark adaptation

1.2.5 視網(wǎng)膜分區(qū)與數(shù)據(jù)采集 鱖視網(wǎng)膜不具有中央凹結(jié)構(gòu)，視錐細(xì)胞在視網(wǎng)膜中分布雖有區(qū)域性，但整體較為均勻[13，15]。故本試驗(yàn)中將視網(wǎng)膜分為4區(qū)(D-N,背-鼻區(qū); D-T，背-顳區(qū);V-N，腹-鼻區(qū); V-T，腹-顳區(qū))，同時(shí)視網(wǎng)膜邊緣有一狹窄的生成帶，均為感光細(xì)胞前體，形態(tài)不易區(qū)分，本研究中未做討論(圖2)。特定發(fā)育階段選取5片完整視網(wǎng)膜，在每片視網(wǎng)膜各區(qū)域隨機(jī)采樣5次，各區(qū)域不同時(shí)期各獲得16個(gè)左右的樣本數(shù)，進(jìn)行后續(xù)桿細(xì)胞數(shù)和對應(yīng)Q4值的統(tǒng)計(jì)分析。

N—鼻側(cè)； D—背側(cè)； T—顳側(cè)； V—腹側(cè)； D-N—背-鼻區(qū)； D-T—背-顳區(qū)； V-N—腹-鼻區(qū)； V-T—腹-顳區(qū)； 藍(lán)色窄帶示視網(wǎng)膜發(fā)生區(qū)；左下角示鱖魚方向與視網(wǎng)膜方向的對應(yīng)關(guān)系。N—nose side; D—dorsal side; T—temporal side; V—ventral side; D-N—dorsal-nose side; D-T—dorsal-temporal side; V-N—ventral-nose side; V-T—ventral-temporal side; the blue narrow band shows the germinal zone of retina;the lower left corner shows the direction correspondence between mandarinfish and retina.圖2 視網(wǎng)膜分區(qū)Fig.2 Division on retina

1.2.6 視錐細(xì)胞排布規(guī)則性的定量分析 引入Q4值作為衡量細(xì)胞排布規(guī)則性的參數(shù)，具體算法參照Salbreux等[17]的方法：Q4=0時(shí)表示單個(gè)細(xì)胞相對于其周圍細(xì)胞排列完全隨機(jī)，區(qū)域細(xì)胞群體平均Q4=0時(shí)表示細(xì)胞總體平面排列完全隨機(jī)；相反，Q4=1時(shí)表示單個(gè)細(xì)胞相對于外周細(xì)胞嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化排列，而區(qū)域細(xì)胞群體平均Q4=1時(shí)則表示細(xì)胞群呈現(xiàn)出完美的平面排列?；贛ATLAB (R2018b)軟件(MathWorks，Natick，USA)計(jì)算所選圖像中視錐細(xì)胞群體的Q4值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析和最小顯著性差異多重比較法進(jìn)行處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，數(shù)據(jù)處理使用IBM SPSS 22 軟件(Armonk，NY，USA)完成，顯著性水平設(shè)為0.05。

表1 試驗(yàn)用抗體和熒光顯色劑信息Tab.1 Informations on antibody and fluorescent chromogenic agent in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 視覺轉(zhuǎn)變期視桿細(xì)胞數(shù)量的增長特點(diǎn)

從圖3(a)、(b)可見：鱖視覺轉(zhuǎn)變期視網(wǎng)膜各區(qū)域視桿細(xì)胞數(shù)均出現(xiàn)顯著增長，且各區(qū)域D28、D42、D633個(gè)時(shí)期間均有顯著性差異(P<0.05)；視網(wǎng)膜腹側(cè)(V側(cè))視桿細(xì)胞數(shù)量最多且增長快，如腹-鼻區(qū)中100 μm2內(nèi)視桿細(xì)胞數(shù)，D28時(shí)期為473±178，D42時(shí)期為3 101±876，而D63時(shí)期已達(dá)5 505±1 103；視網(wǎng)膜背側(cè)(D側(cè))視桿細(xì)胞數(shù)量在D28、D42、D63時(shí)期也出現(xiàn)了顯著增長，數(shù)量略小于腹側(cè)，但也積累到了較高的數(shù)量，如背-顳區(qū)中100 μm2內(nèi)視桿細(xì)胞數(shù)在D63時(shí)期已達(dá)5 135±820；發(fā)育過程中，視桿細(xì)胞在視網(wǎng)膜全區(qū)域生長較為均勻，各時(shí)期視網(wǎng)膜腹側(cè)與背側(cè)視桿細(xì)胞的數(shù)量無顯著性差異(P>0.05)。

從圖3(c)可見：視桿細(xì)胞與視錐細(xì)胞之比(R/C)在整個(gè)視覺轉(zhuǎn)變期發(fā)生了劇烈變化，且視網(wǎng)膜各區(qū)域D28、D42、D633個(gè)時(shí)期間均有顯著性差異(P<0.05)；視網(wǎng)膜各區(qū)域均表現(xiàn)為視桿細(xì)胞逐漸占據(jù)感光細(xì)胞的主體，如背-顳區(qū)中，D28時(shí)期R/C平均值為4.3±0.4，而D63時(shí)期已上升到42.3±10.6。這種R/C值的顯著變化不僅說明同一時(shí)期視桿細(xì)胞與視錐細(xì)胞數(shù)量組成情況，也反映出這一時(shí)期視桿細(xì)胞遠(yuǎn)高于視錐細(xì)胞的增長速度。另外，視網(wǎng)膜各區(qū)域D28時(shí)期R/C值均未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，但到D42、D63時(shí)期，背側(cè)的背-鼻區(qū)與背-顳區(qū)R/C值均顯著高于腹側(cè)的腹-鼻區(qū)與腹-顳區(qū) (P<0.05)，這也說明視錐細(xì)胞在視網(wǎng)膜胚后發(fā)育中逐漸出現(xiàn)區(qū)域化，腹區(qū)視錐細(xì)胞數(shù)量逐漸高于背區(qū)。

2.2 視覺轉(zhuǎn)變期視錐細(xì)胞的增長特點(diǎn)

鱖視覺轉(zhuǎn)變期視錐細(xì)胞數(shù)量的變化較為獨(dú)特，其中單錐細(xì)胞數(shù)量在整個(gè)發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)出下降趨勢，且視網(wǎng)膜各區(qū)域D28、D42、D633個(gè)時(shí)期間單錐細(xì)胞數(shù)均有顯著性差異(P<0.05)(圖4(a))，而雙錐細(xì)胞數(shù)量則呈上升趨勢，且視網(wǎng)膜各區(qū)域D28、D42、D633個(gè)時(shí)期間雙錐細(xì)胞數(shù)均有顯著性差異(P<0.05)(圖4(b))；雙錐與單錐細(xì)胞數(shù)之比(DC/SC)隨發(fā)育時(shí)間的延長明顯上升，視網(wǎng)膜各區(qū)域D28、D42、D633個(gè)時(shí)期間DC/SC值均有顯著性差異(P<0.05)(圖4(c))。以背-顳區(qū)為例，100 μm2內(nèi)，隨發(fā)育時(shí)間的延長單錐細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，D28時(shí)期為 31±6，D42時(shí)期為15±9，D63時(shí)期減少至8±3，雙錐細(xì)胞數(shù)量顯著提高，D28時(shí)期為74±17， D42時(shí)期為88±21，D63時(shí)期增加至103±17，D28、D42、D63時(shí)期DC/SC值分別為2.4±0.3、5.72±0.9、12.8±1.9。

單錐細(xì)胞數(shù)量在整個(gè)視覺轉(zhuǎn)變期平緩下降，而雙錐細(xì)胞數(shù)增長速度在D42～D63時(shí)期明顯高于D28～D42時(shí)期，如D63時(shí)期的背-顳區(qū)中DC/SC值已達(dá)到12.8±1.9，而在DC/SC值較低的腹-鼻區(qū)中D63時(shí)期數(shù)值也達(dá)到了6.5±1.1(圖4(c))。

在D63階段，背-鼻區(qū)與背-顳區(qū)的DC/SC值無顯著性差異(P>0.05)，腹-鼻區(qū)與腹-顳區(qū)的DC/SC值也無顯著性差異(P>0.05)，而背側(cè)(背-鼻區(qū)和背-顳區(qū))與腹側(cè)(腹-鼻區(qū)和腹-顳區(qū))的DC/SC值存在顯著性差異(P<0.05)，這說明D63時(shí)期腹側(cè)單錐細(xì)胞較背側(cè)多，而在D28和D42時(shí)期視網(wǎng)膜各區(qū)的DC/SC值變化同D63時(shí)期，只是沒有D63時(shí)期DC/SC值變化大(圖4(c))，這說明處于視覺轉(zhuǎn)變期的視錐細(xì)胞群體中，雙錐細(xì)胞生成速度明顯快于單錐細(xì)胞，對各時(shí)期一定區(qū)域單錐與雙錐細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也從側(cè)面證明了這點(diǎn)。

2.3 視桿細(xì)胞與視錐細(xì)胞排布的相關(guān)性

為分析鱖視網(wǎng)膜中視錐細(xì)胞間隔處視桿細(xì)胞的數(shù)量變化是否影響視錐細(xì)胞排布，對視網(wǎng)膜不同區(qū)域100 μm2內(nèi)的視桿細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。首先對特定時(shí)期視網(wǎng)膜各區(qū)域感光細(xì)胞層進(jìn)行分析。在D63時(shí)期，Crb2a蛋白在視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞輪廓上有明顯的標(biāo)記，其中在雙錐細(xì)胞間隔的窄縫中分布較少，大部分分布在細(xì)胞間隔處；同時(shí)，在錐體細(xì)胞間隔處混合了大量的視桿細(xì)胞 (圖5)。視網(wǎng)膜各時(shí)期各區(qū)域視桿細(xì)胞數(shù)與對應(yīng)視錐細(xì)胞排布的平均Q4值如圖6所示，如D63時(shí)期背側(cè)和腹側(cè)的平均Q4值分別為0.69(n=15)和0.62(n=16)，背側(cè)和腹側(cè)的視桿細(xì)胞數(shù)未隨Q4值的變化出現(xiàn)明顯浮動(圖6E、F)，D28、D42時(shí)期的視桿細(xì)胞數(shù)與Q4值的關(guān)系也與D63時(shí)期相似(圖6A～D)。結(jié)果表明，在特定發(fā)育階段，視錐細(xì)胞間隙的視桿細(xì)胞數(shù)量與視錐細(xì)胞排布規(guī)律性無明顯相關(guān)性。

標(biāo)有不同小寫字母者表示同一區(qū)域不同時(shí)期間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母者表示同一時(shí)期不同區(qū)域間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同。Means with different small letters are significant difference in different developmental periods in the same region (P<0.05)，means with different capital letters are significant differences in different regions with the same developmental period (P<0.05)，and means with the same letters are not significant difference between groups (P>0.05)， et sequentia.圖3 鱖視覺轉(zhuǎn)變期視桿細(xì)胞增長特點(diǎn)Fig.3 Growth characteristics of rod cell in mandarinfish during visual transition period

圖4 鱖視覺轉(zhuǎn)變期視錐細(xì)胞增長特點(diǎn)Fig.4 Growth characteristics of cone cells of mandarinfish during visual transition period

圖5 特定時(shí)期視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞排布特點(diǎn) (以D63為例)Fig.5 Arrangement characteristics of cone cell mosaic in specific period (i.e.D63)

圖6 各時(shí)期特定區(qū)域視桿細(xì)胞數(shù)與對應(yīng)視錐細(xì)胞排布的平均Q4值的關(guān)系Fig.6 Relationship between the rod cell number and the mean Q4 value of cone cell mosaic in each period

在D28時(shí)期，視桿細(xì)胞以較低密度分布在視錐細(xì)胞狹窄的間隙中，在D28～D63時(shí)期，視錐細(xì)胞間隙的視桿細(xì)胞數(shù)量急劇增加(P<0.01)(圖3(a)，圖7(a))；各時(shí)期視桿細(xì)胞的顯著增加并不影響視錐細(xì)胞排布，主要表現(xiàn)為平均Q4值無明顯變化(P>0.05)(圖7(b))。這也說明，在不同發(fā)育階段，視桿細(xì)胞數(shù)量的急劇增加與視錐細(xì)胞排布的規(guī)律性無直接關(guān)系。

3 討論

3.1 鱖視覺轉(zhuǎn)變期視網(wǎng)膜中視桿細(xì)胞的變化

本研究表明，鱖視桿細(xì)胞數(shù)量在視覺轉(zhuǎn)變期出現(xiàn)劇烈增長，這與晝間活動魚類的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)有明顯不同，如斑馬魚視桿細(xì)胞數(shù)量較少，且終身維持在一定范圍內(nèi)[6，17，19]。同時(shí)，鱖視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在胚后發(fā)育過程中增長緩慢[13-15]，大量視桿細(xì)胞與下游較少神經(jīng)節(jié)細(xì)胞所組成的高度匯聚感受野是增強(qiáng)魚類視網(wǎng)膜感光能力的關(guān)鍵因素之一[1，3]。本試驗(yàn)中，鱖視網(wǎng)膜胚后發(fā)育時(shí)期視桿細(xì)胞的大量出現(xiàn)，由視桿與視錐細(xì)胞數(shù)量的比值可以看出，視桿細(xì)胞在鱖視覺轉(zhuǎn)變期及后續(xù)發(fā)育階段將占據(jù)感光細(xì)胞的絕對主體。推測鱖D63時(shí)期，視桿細(xì)胞與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞匯聚程度增高，這種結(jié)構(gòu)極大增強(qiáng)了鱖視網(wǎng)膜對于光線的敏感性。視桿細(xì)胞急劇增長也與此階段鱖生活習(xí)性、捕食習(xí)性的變化相對應(yīng)，主要表現(xiàn)為鱖視網(wǎng)膜感光能力增強(qiáng)，鱖苗逐漸畏懼強(qiáng)光，趨于暗光下活動[9,12]。

標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母者表示組間有極顯著性差異(P<0.01)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different small letters being significantly different at the 0.05 probability level, the means with different capital letters are significantly different at the 0.05 probability level， and the means with the same letter are not significant differences.圖7 各時(shí)期視桿細(xì)胞平均數(shù)量與視錐細(xì)胞排布的平均Q4值Fig.7 Average rod cell number and the mean Q4 of cone cell mosaic in each period

3.2 鱖視覺轉(zhuǎn)變期視網(wǎng)膜中視錐細(xì)胞的變化

本研究中視覺轉(zhuǎn)變期，鱖視網(wǎng)膜中雙錐細(xì)胞逐漸占據(jù)了視錐細(xì)胞的主體。而雙錐細(xì)胞的大量出現(xiàn)被認(rèn)為是魚類視網(wǎng)膜增強(qiáng)其感光能力的適應(yīng)性結(jié)構(gòu)變化，主要表現(xiàn)為視錐細(xì)胞與下游神經(jīng)節(jié)細(xì)胞而言逐漸失去了一對一的精確對應(yīng)關(guān)系，辨色能力與成像能力下降，而出現(xiàn)視錐細(xì)胞與下游神經(jīng)節(jié)細(xì)胞多對一的關(guān)系，視錐細(xì)胞相對下游神經(jīng)節(jié)細(xì)胞匯聚程度增加[1，3]。本研究中D28時(shí)期以后，雙錐細(xì)胞的顯著增加與單錐細(xì)胞的緩慢增長造成視錐細(xì)胞種類的單一化，可能造成鱖視網(wǎng)膜胚后發(fā)育過程中辨色能力逐步下降。

魚類視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞的區(qū)域密度與組成直接決定了視網(wǎng)膜在各個(gè)方向上的成像能力[20-21]。本研究中，鱖視網(wǎng)膜腹側(cè)單錐細(xì)胞數(shù)量高于背側(cè)，D42～D63時(shí)期腹側(cè)雙錐與單錐細(xì)胞數(shù)量的比值逐步低于背側(cè)，D42時(shí)期以后鱖視網(wǎng)膜腹側(cè)單錐細(xì)胞含量較多，視錐細(xì)胞種類較背側(cè)豐富。這表明鱖視網(wǎng)膜腹側(cè)的成像能力與辨色能力應(yīng)高于背側(cè)，這也與鱖逐漸營底棲生活捕食水體上層魚類的捕食習(xí)性相對應(yīng)[12-15]。

3.3 鱖視網(wǎng)膜中視桿細(xì)胞發(fā)育對視錐細(xì)胞排布構(gòu)建的影響

分化中的視桿細(xì)胞與視錐細(xì)胞來源于不同的祖細(xì)胞[22-23]，同時(shí)，視桿細(xì)胞出現(xiàn)在視錐細(xì)胞間隔處的時(shí)間比視錐細(xì)胞排布形成的時(shí)間晚[17，19]。晝間活動的斑馬魚視網(wǎng)膜發(fā)育中，視桿細(xì)胞對視桿細(xì)胞排布的形成并無明顯影響[17，19]，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論一致。同時(shí)，本研究中提供了新的結(jié)論，表明在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中視桿細(xì)胞在視錐細(xì)胞排布形成過程中無影響，特別是在一些類似鱖這樣棲息于暗光下視網(wǎng)膜中具有豐富視桿細(xì)胞的魚類中，視網(wǎng)膜發(fā)育過程中視桿細(xì)胞數(shù)量的急劇增加并不影響視錐細(xì)胞排布的形成。簡而言之，鱖視桿細(xì)胞數(shù)量的增長對視錐細(xì)胞排布形成幾乎無影響。這也說明在視覺轉(zhuǎn)變期，鱖視網(wǎng)膜趨向于增強(qiáng)感光能力的結(jié)構(gòu)變化過程中，視桿細(xì)胞的大量增生并不會影響鱖的視銳度，這使得鱖在視覺轉(zhuǎn)變期中視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)既適應(yīng)了暗光感受，又保證了基本的成像能力。

4 結(jié)論

1)通過對鱖視覺轉(zhuǎn)變期視網(wǎng)膜中感光細(xì)胞發(fā)育特征的分析，發(fā)現(xiàn)鱖視覺轉(zhuǎn)變期視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層在結(jié)構(gòu)上發(fā)生了劇烈變化，各類感光細(xì)胞數(shù)量與比例變化明顯。

2)視桿細(xì)胞在視網(wǎng)膜各區(qū)域均勻增長，視錐細(xì)胞區(qū)域化增長，其中腹側(cè)增長速度明顯快于背側(cè)，兩個(gè)發(fā)育過程相互獨(dú)立，共同為其底棲暗光生活的視覺轉(zhuǎn)變提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。