王廣交，辛嘉英,，崔添玉，李越，夏春谷

(1.哈爾濱商業(yè)大學 食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國科學院 蘭州化學物理研究所 羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

四氫嘧啶(1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-吡啶羧酸)是一種普遍存在于嗜鹽微生物中的環(huán)狀亞氨基酸，其可使細胞在極端環(huán)境下依然保持活性[1-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其可被應用于食品[6-7]、醫(yī)療[8-14]、美容等[15-19]領域。由于四氫嘧啶具有一個手性碳原子，難以化學合成，故選擇生物法合成四氫嘧啶[20-21]。本文探究甲基彎菌MethylosinustrichosporiumOB3b合成四氫嘧啶，該菌存在于泥濘的沼澤或水草茂密的池塘，容易獲得，且可以CH4為唯一碳源生長，使用液體無機鹽培養(yǎng)基在較低鹽濃度下合成四氫嘧啶，經濟價值高，環(huán)境友好，實用性價值高。目前合成四氫嘧啶的工業(yè)菌株有限，以期甲基彎菌MethylosinustrichosporiumOB3b可對四氫嘧啶的生物合成技術提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

甲基彎菌MethylosinustrichosporiumOB3b由清華大學邢新會教授提供，由本文作者實驗室保存，保存條件為4 ℃，保存過程中定期將菌株重復培養(yǎng);氯化銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、正丁醇、甲酸、碘、甲醇、乙腈均為分析純；四氫嘧啶，標準品(≥98%)，潤慧生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純。

UV-5100B紫外可見分光光度計；KH-2000雙波長薄層色譜掃描儀;RV10旋轉蒸發(fā)儀；spectrum Two傅里葉變換紅外光譜儀；U3000高效液相色譜儀；BLBI0-HYG-FJ2生物反應器搖床；LDZX-50KBS立式高壓蒸氣滅菌器；SX2-2.5箱式電阻爐；TGL-16高速臺式離心機；DL-CG-1ND潔凈工作臺。

1.2 四氫嘧啶的制備

1.2.1 培養(yǎng)基 無機鹽培養(yǎng)基液組成(g/L)：NH4Cl 0.5,K2HPO40.524,KH2PO40.262,KNO31，NaCl 1，Na2HPO40.74,CaCl20.015 1,MgSO40.3,FeCl30.001 67,FeSO40.004,MnSO4·H2O 0.003,ZnSO4·7H2O 0.003 4,NaMoO4·H2O 0.002 4。

1.2.2 甲烷氧化菌的培養(yǎng) 取100 mL培養(yǎng)液于250 mL三角瓶中，將在4 ℃下低溫儲存的種子液以10%的接種量接種在培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min空氣浴搖床培養(yǎng)，144 h(6 d)為一個培養(yǎng)周期，期間每隔24 h充一次CH4(CH4與空氣體積比為1∶1)。

1.2.3 四氫嘧啶的提取 由于四氫嘧啶在甲醇、乙腈、水中溶解度較高[22]，故選擇甲醇、乙腈提取甲烷氧化菌中四氫嘧啶,最終溶解于二次蒸餾水中。取10 mL培養(yǎng)一周期的發(fā)酵液在1 800 r/min條件下，離心20 min，分離上清液與菌種。將上清液在140 r/min,40 ℃下旋轉蒸發(fā)，用甲醇溶解結晶，去除不溶沉淀，將溶液再次旋轉蒸發(fā)除去甲醇，使用乙腈溶液溶解結晶，過濾除去不溶性雜質，在140 r/min,40 ℃旋轉蒸發(fā)，除去乙腈溶液，取10 mL二次蒸餾水溶解結晶(粗四氫嘧啶)，轉移至10 mL試管中，備用。

1.3 分析方法

為排除實驗的偶然性，選用紫外可見光譜儀、薄層色譜、紅外光譜多種定性分析方法分析從甲基彎菌OB3b中提取的樣品。

1.3.1 紫外-可見光譜定性檢測四氫嘧啶 以水溶解四氫嘧啶標準品(95%純度)，使用UV2450紫外可見光譜儀檢測四氫嘧啶標準品在190～230 nm處的紫外吸收，以水溶解提取物在相同檢測條件下檢測，比較最大吸收峰位置與峰型。

1.3.2 薄層層析定性檢測四氫嘧啶 通過薄層色譜輔助紫外-可見光譜實現(xiàn)快速對甲烷氧化菌OB3b中提取的四氫嘧啶定性分析。使用GF254型硅膠板，以正丁醇-甲酸-水混合液(V/V/V,6∶2∶2)為展層劑，以碘為顯色劑，使用KH-2000型薄層色譜掃描儀觀測樣品與標準品進行比較。

1.3.3 紅外光譜定性檢測四氫嘧啶 由于紫外-可見光譜與薄層色譜檢測都存在一定的偶然性，為確保實驗準確性,做進一步紅外光譜檢測。取0.25 g KBr研磨均勻，使用壓片機壓片，將壓片置于紅外光譜儀光路中進行背景掃描，扣除KBr與空氣背景。分別將一定量的標準品、樣品與0.25 g KBr混合均勻，研磨，壓片，掃描，將樣品的紅外光譜圖與標準品的紅外光譜進行比較。

1.3.4 四氫嘧啶的定量檢測方法 選用高效液相色譜法，使用 Eclipse XDBC18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，在柱溫為27.5 ℃柱壓力為35.3 MPa條件下定量檢測四氫嘧啶。以乙氰/甲醇(體積比為95∶5)混合溶液為流動相，流速為1 mL/min的條件下運行10 min。標準四氫嘧啶以二次蒸餾水為溶劑,配成0.5 g/L的溶液，使用0.23 μm的水系膜過濾，樣品經過同樣的處理，在以上檢測條件下進行檢測。根據(jù)標準品的濃度、峰面積及樣品的峰面積計算樣品的濃度。

2 結果與討論

2.1 紫外-可見光譜檢測結果

紫外-可見光譜檢測結果見圖1。

圖1 四氫嘧啶紫外-可見光譜檢測結果圖Fig.1 UV-visible spectrum of ectoine

由圖1可知，標準品在205 nm波長下有最大吸收峰，甲烷氧化菌中提取四氫嘧啶最大吸收峰位置在200～205 nm，峰型與標準品幾乎相同。

根據(jù)以上檢測結果，在205 nm下測定樣品可實現(xiàn)對樣品的初步快速定性檢測，并可以根據(jù)標準品在205 nm下的標準曲線對樣品快速做出初步的定量分析。標準曲線R2值為0.999 8，方程為y=4.292 8x+0.082 4(x為檢測樣濃度，y為檢測樣在205 nm處吸光值)。

2.2 薄層層析檢測結果

薄層層析檢測結果見圖2。

圖2 TLC定性檢測甲烷氧化菌O3Bb中四氫嘧啶含量Fig.2 TLC of ectoine from Methylosinus trichosporium OB3b

由圖2可知，四氫嘧啶在硅膠板上出現(xiàn)明顯的點，與標準品相比較，其Rf值基本一致,點2有一部分物質隨展層劑擴散到與標準品相似高度，一部分物質未隨展層劑擴散，推測該成分中可能含有羥基四氫嘧啶。由于四氫嘧啶是羥基四氫嘧啶的前體，且他們結構及性質極其相似，所以他們經常同時存在并且難以分離，其他菌株合成四氫嘧啶的研究中也存在這一問題。該方法可能可將四氫嘧啶與羥基四氫嘧啶分離開，提高四氫嘧啶純度。

2.3 紅外色譜檢測結果

四氫嘧啶的紅外光譜見圖3。

圖3 四氫嘧啶紅外圖譜Fig.3 IR spectrometry of ectoine

由圖3可知，四氫嘧啶標準品與四氫嘧啶提取樣品的紅外圖譜特征明顯。由于提取樣品純度相對標準品較低，其中含有其他雜質，故樣品的紅外光譜發(fā)生藍移。

根據(jù)以上定性檢測結果，可以初步判定甲基彎菌MethylosinustrichosporiumOB3b在最適鹽濃度下可以合成四氫嘧啶。

2.4 高效液相色譜檢測結果

在最適鹽濃度下培養(yǎng)甲烷氧化菌，使用有機溶劑提取培養(yǎng)一周期(6 d)后菌種內外的四氫嘧啶，為得到均一穩(wěn)定的高效液相色譜圖，將樣品稀釋8～64倍，在紫外檢測器中檢測到明顯吸收峰后，在高效液相色譜中進樣，將檢測結果樣品圖與標準品的高效液相色譜圖進行比較，結果見圖4。

圖4 四氫嘧啶高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of ectoine

由圖4可知，提取樣品出峰時間在1.373～1.390 min，峰型與出峰時間均與標準品相似，說明甲烷氧化菌中含有四氫嘧啶，并可使用該方法定量分析。

2.5 合成四氫嘧啶產量

由檢測得到的標準品與樣品的峰面積，用式(1)和(2)計算,細胞內外四氫嘧啶產量和為(84.9±5.49) mg/(g·d)，最大產量為139.75 mg/(g·d)，低于工業(yè)生長菌株[工業(yè)用菌最大產量為150.5 mg/(g·d)][21]，但略高于使用Methylomicrobiumalcaliphilum20Z合成四氫嘧啶的產量(70.4±14.3) mg/(g·d)。 用式(3)計算釋放率(釋放到細胞外的四氫嘧啶所占總四氫嘧啶的百分含量),為83.09%～96.63%。

(1)

(2)

(3)

式中A1——標準四氫嘧啶峰面積；

A2——提取四氫嘧啶峰面積；

C1——標準四氫嘧啶濃度，mg/mL；

C2——提取四氫嘧啶濃度，mg/mL；

m1——細胞干重，g；

V——溶液的體積，mL；

T——培養(yǎng)時間，d；

Q——四氫嘧啶產量，mg/(L·d)；

m外——細胞外四氫嘧啶質量，mg；

m——細胞內外四氫嘧啶總質量,mg；

W——四氫嘧啶釋放率，%。

3 結論

甲烷氧化菌MethylosinustrichosporiumOB3b可以合成并分泌四氫嘧啶，在較低鹽濃度條件下同樣可以合成四氫嘧啶，這可以解決細胞在高鹽濃度下難以積累以及高鹽濃度對設備的損害兩大目前工業(yè)生產所面對的難題。雖然該菌株合成四氫嘧啶的產量低于工業(yè)生長菌株[工業(yè)用菌最大產量為150.5 mg/(g·d)]，但其產量略高于使用Methylomicrobiumalcaliphilum20Z合成四氫嘧啶的產量(70.4±14.3) mg/(g·d)，并且在后續(xù)研究中培養(yǎng)條件的優(yōu)化可以使四氫嘧啶的產量得到提高。

與工業(yè)菌株長鹽單胞菌(Halomonaselongate)相比，甲烷氧化菌可以甲烷為唯一碳源生長，經濟價值高于以糖為碳源生長的工業(yè)菌株，使用液體無機鹽培養(yǎng)基，提取純化工藝相比固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌較簡單，但甲基彎菌OB3b相比其他菌生長速度低，待進一步研究，以期工業(yè)使用。