歐陽艾 羅雨珩 陸 農(nóng) 胡仁濤 張平玉 張黔玲

(深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，深圳 518071)

0 引言

亞細(xì)胞器粘度是最重要的微環(huán)境參數(shù)之一，它通過影響活細(xì)胞內(nèi)生物分子和化學(xué)信號的相互作用來促進生物學(xué)功能[1-4]。細(xì)胞的粘度與很多疾病息息相關(guān)，如動脈粥樣硬化[5]、糖尿病[6]、阿爾茲海默病[7]、惡性腫瘤等[8]。此外，一些影響細(xì)胞內(nèi)粘度的藥物可以用來調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)受體的凈通量，從而降低神經(jīng)活性，因此，細(xì)胞內(nèi)粘度探針的研究和開發(fā)對于相關(guān)疾病的診斷具有重大意義。

線粒體是能量工廠，是傳導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[9]。細(xì)胞內(nèi)粘度影響著細(xì)胞膜中蛋白質(zhì)之間的相互作用[10]，此外，線粒體基質(zhì)中的粘度與線粒體網(wǎng)絡(luò)組織、線粒體呼吸、代謝和代謝物擴散密切相關(guān)[3,11]。近來，一些具有分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)動力學(xué)特性的熒光分子轉(zhuǎn)子已被設(shè)計用于檢測細(xì)胞內(nèi)粘度。由于內(nèi)部旋轉(zhuǎn)特性，它們通常具有較低的量子產(chǎn)率，而隨著粘度的增加旋轉(zhuǎn)會受到限制，熒光隨之增強[12]。粘度的定量測量可以使用具有粘度依賴性和非依賴性發(fā)光帶的比值粘度監(jiān)測器來實現(xiàn)[13]。此外，還可以通過引入靶向基團開發(fā)以針對特定細(xì)胞器的粘度檢測的探針[2,14-16]。

近年來，光動力療法(PDT，photodynamic therapy)作為一種微創(chuàng)且高效的癌癥治療方法引起了越來越多的關(guān)注。PDT由于高選擇性、顯著的靶向治療效果以及較低的毒副作用，已成為化療的替代方法[17-18]。PDT通過使用光敏劑(photosensitizers，PSs)、光輻射和基態(tài)氧發(fā)揮作用，在適當(dāng)波長的光照射下，PS可以與基態(tài)氧相互作用產(chǎn)生高細(xì)胞毒性的單線態(tài)氧(1O2)，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[19]。與傳統(tǒng)癌癥治療手段相比，PDT能最大限度地降低對機體的器質(zhì)性損傷，治療時間短，而且能夠深入病灶對腫瘤進行治療。

金屬配合物由于具有優(yōu)異的光物理和化學(xué)特性，在發(fā)光探針和光動力治療中顯示出巨大的潛力[20]，例如作為氧氣、離子、靶向細(xì)胞器和生物分子的探針及光敏劑等[21-30]。金屬配合物的主要優(yōu)點包括[31]：（ⅰ）具有高的光穩(wěn)定性，可用于實時監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的變化；（ⅱ）具有高的熒光量子產(chǎn)率、大斯托克斯位移和相對長的發(fā)光壽命而被廣泛應(yīng)用于靶向細(xì)胞器成像；（ⅲ）具有豐富的電荷轉(zhuǎn)移激發(fā)態(tài)、結(jié)構(gòu)可塑性等[32]，可作為光敏劑有效地殺死癌細(xì)胞[33]。鑒于此，我們設(shè)計了2個對粘度具有靈敏熒光響應(yīng)的銥配合物，可對線粒體內(nèi)的粘度進行熒光成像檢測，同時表現(xiàn)出高效光動力治療效果。如圖1所示，Ir1和Ir2在水溶液中可以自由旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致熒光猝滅，而在粘度環(huán)境下，旋轉(zhuǎn)受阻，從而熒光上升。粘度環(huán)境中的熒光配合物在光照的條件下，產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧，可有效地用于腫瘤的光動力治療。

圖1 Ir1和Ir2的粘度響應(yīng)機理與光動力效應(yīng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of viscosity response mechanism and photodynamic therapy of Ir1 and Ir2

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

所用儀器有：BrukerAV-500MHz核磁共振儀、CHN/O/S元素分析儀(CE440)、UV-2550紫外可見分光光度計、F-7000熒光光譜儀、Bruker電子順磁共振儀、Zeiss LSM880共聚焦掃描顯微鏡。

實驗中所用試劑均為分析純，反應(yīng)中所有溶劑都按照溶劑手冊進行蒸餾除水。

1.2 合 成

銥配合物Ir1與Ir2的合成路線如圖2所示，主要有3步，先由三氯化銥水合物與二苯基喹啉配體合成銥配合物前體，再由前體和配體2-(4-(2-乙炔基)苯基)-1H-咪唑并[4，5-f][1，10]-菲咯啉(EPIP)合成Ir1，最后用單核銥配合物Ir1通過炔烴偶聯(lián)反應(yīng)合成雙核銥配合物Ir2，其中配體EPIP根據(jù)文獻(xiàn)報道進行合成[34]。我們選擇EPIP配體的原因有2個，其一是EPIP配體具有可旋轉(zhuǎn)的單鍵但在粘度條件下旋轉(zhuǎn)受阻的特性，這是我們探索粘度探針的研究思路；其二是EPIP配體含有的炔基基團可以設(shè)計合成雙核銥化合物Ir2，從而對比Ir1和Ir2的性質(zhì)區(qū)別?；衔颷Ir(2pq)2Cl2]的合成：稱取 IrCl3(1 mmol)和 2-苯基喹啉配體(2.15 mmol)，置于40 mL乙二醇乙醚和水(3∶1，V/V)的混合溶劑中，在氮氣保護下于加熱器中120℃回流24 h。冷卻至室溫后，減壓過濾收集固體，并用乙醚洗滌3次，干燥后獲得橙紅色粉末。

圖2 Ir1和Ir2的合成路線圖Fig.2 Synthetic routes of Ir1 and Ir2

化合物Ir1的合成：稱取[Ir(2pq)2Cl2](0.1 mmol)和配體EPIP(0.21 mmol)置于100 mL的圓底燒瓶中，加入30 mL二氯甲烷和甲醇(2∶1，V/V)的混合溶劑，在氮氣保護下于加熱器中65℃下回流8 h。冷卻至室溫后，減壓過濾收集固體，用水和乙醚洗滌3次并干燥后得到橘黃色粉末，即為Ir1，產(chǎn)率為88.5%。ESI-MS：m/z921.2[M-Cl]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)：δ9.12(s，2H)，8.62(d，J=8.9 Hz，2H)，8.51(d，J=8.9 Hz，2H)，8.34(dd，J=16.7，8.0 Hz，5H)，8.04(s，3H)，7.81(d，J=7.3 Hz，2H)，7.63(d，J=7.5 Hz，2H)，7.21(dt，J=15.9，8.1 Hz，6H)，6.96～6.71(m，4H)，6.52(d，J=7.3 Hz，2H)，4.38(s，1H)。 元 素 分 析 按C51H32ClIrN6計算值(%)：C 64.04，H 3.37，N 8.79；實驗值(%)：C 64.05，H 3.39，N 8.72。

化合物Ir2的合成[35]：將二氯甲烷(40 mL)、氯化亞銅粉末(110 mmol)和四甲基乙二胺(110 mmol)置于100 mL的圓底燒瓶中，向其鼓入純凈空氣。隨后稱取Ir1(22.0 mmol)溶解于15 mL的二氯甲烷中，用分液漏斗滴入到上述溶液中，混合過夜攪拌。用水洗滌分液，有機相二氯甲烷用硫酸鎂干燥后，旋蒸除去二氯甲烷得到粗品。最后通過柱色譜法提純，以水、乙腈和硝酸鉀混合溶液為流動相(10∶1∶0.1，V/V)進行洗脫純化，得到橙色粉末為產(chǎn)物Ir2，產(chǎn)率63%。ESI-MS：m/z919.2[M-2Cl]2+/2。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)：δ8.90(s，4H)，8.60(d，J=9.0 Hz，4H)，8.55～8.46(m，5H)，8.35(d，J=8.4 Hz，4H)，8.30(d，J=7.6 Hz，4H)，8.19(s，4H)，7.88(s，4H)，7.80(d，J=7.1 Hz，4H)，7.64(s，5H)，7.21(dd，J=19.4，11.1 Hz，10H)，6.94～6.77(m，8H)，6.57(s，1H)，6.52(d，J=7.4 Hz，3H)。元素分析按 C102H62Cl2Ir2N12計算值(%)：C 64.11，H 3.27，N 8.80；實驗值(%)：C 64.06，H 3.33，N 8.84。

1.3 不同粘度中熒光強度和熒光壽命的測試

利用甘油與純水來配制不同粘度的溶液體系，具體為用甘油與純水依次配制體積比為0%～99%的混合溶劑，加入配合物母液后配制成濃度為10 μmol·L-1的不同粘度的樣品溶液，依次測量配合物在不同粘度體系中的熒光發(fā)射光譜，同時在紫外線下拍攝其光學(xué)圖片。最后分別取配合物在555 nm(Ir1)和557 nm(Ir2)處的發(fā)射強度與對應(yīng)的粘度數(shù)值進行對數(shù)函數(shù)擬合。

1.4 1O2量子產(chǎn)率測定

利用對亞硝基二甲基苯胺(RNO)檢測配合物產(chǎn)生的1O2量子產(chǎn)率，具體為：分別以甘油體積分?jǐn)?shù)為0%和80%的甘油-純水混合溶劑配制濃度均為10 mmol·L-1的RNO溶液和組氨酸溶液，以3 mL組氨酸溶液作為溶劑(空白)，不斷滴加配合物母液，使配合物溶液在465 nm處的吸收強度為0.1，以此濃度的配合物溶液作為參比溶液，在另一份相同的溶液中加入6 μL的RNO溶液作為樣品溶液，測定其440 nm處的吸收強度為A0。隨后使用功率為10 mW·cm-2的465 nm光源持續(xù)照射樣品溶液5 min，測量其在440 nm處的吸收強度為A，記錄每次光照后的440 nm處的吸收值(總共光照時長為30 min)。最后以光照時間為橫軸，以A0-A為縱軸，擬合曲線，按照文獻(xiàn)中的方法[4]計算配合物1O2量子產(chǎn)率(Φ)，以光敏劑[Ru(bpy)3]2+作為對照(Φref,1O2=0.22)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

Hep-G2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)、LO2細(xì)胞(人正常肝細(xì)胞)、A549細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞)和MRC-5細(xì)胞(人正常肺細(xì)胞)購于ATCC細(xì)胞庫。以DMEM作為細(xì)胞培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、1%的雙抗(青霉素和鏈霉素)，細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞共聚焦熒光成像

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔1×106個細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中。細(xì)胞貼壁后，加入含有10 μmol·L-1的銥配合物的培養(yǎng)液，孵育1 h后吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次。用線粒體紅色染料MitoTrackers?Red或溶酶體紅色染料LysoTrackers?Red染色30 min，用PBS清洗3次后，置于激光共聚焦顯微鏡下進行拍照成像。

1.7 細(xì)胞光、暗毒性測試

2 結(jié)果與討論

2.1 光物理和化學(xué)性質(zhì)

Ir1和Ir2在水溶液中(含0.2% DMSO)的紫外可見吸收光譜如圖3所示。Ir1和Ir2在近紫外280～400 nm處強吸收峰歸屬為配體內(nèi)部的電荷轉(zhuǎn)移峰(ILCT)；在400 nm左右，2個配合物均具有一個較弱的吸收帶，這歸屬為配合物中金屬中心銥原子到配體間的MLCT電子躍遷峰。用405 nm波長激發(fā)，Ir1和Ir2在水溶液中的熒光發(fā)射光譜如圖3所示，Ir1在555 nm處有黃色的熒光發(fā)射，而Ir2在557 nm處幾乎沒有熒光發(fā)射，相比于單核銥配合物Ir1，雙核銥配合物Ir2熒光被猝滅。

圖3 Ir1和Ir2的紫外可見吸收光譜和熒光光譜圖Fig.3 UV-Vis absorption spectra and emission spectra of Ir1 and Ir2

2.2 對粘度的熒光強度響應(yīng)

Ir1和Ir2在不同粘度的甘油-水體系中的熒光發(fā)射情況如圖4所示。在405 nm激發(fā)下，隨著甘油體積分?jǐn)?shù)的增大，體系粘度增大，Ir1和Ir2相應(yīng)的熒光強度顯著增強。將溶劑從純水變成體積分?jǐn)?shù)99%的甘油體系時，Ir1探針的熒光強度增強約35.7倍，Ir2探針的熒光強度增強約1 311.6倍，因此，Ir2對粘度響應(yīng)更加明顯和靈敏。Mao等報道了銥（Ⅲ）配合物粘度探針在高粘度環(huán)境下熒光增強了6.4倍[16]，與其相比，Ir1和Ir2均具有非常靈敏的粘度響應(yīng)。隨后采用對數(shù)函數(shù)對探針的發(fā)射強度的對數(shù)值(lgI)和粘度的對數(shù)值(lgη)進行擬合，發(fā)現(xiàn)其相關(guān)系數(shù)都在0.99以上，表明Ir1和Ir2探針可對溶液體系的粘度進行定量測定。同時在紫外燈下可以明顯觀察到，隨著粘度的不斷增大，Ir1和Ir2的黃色熒光逐漸增強，即可通過肉眼觀察熒光強弱來判定溶液體系的粘度大小，可作為一種可視化的熒光探針。

圖4 Ir1和Ir2在不同粘度體系中的熒光圖片、熒光光譜圖以及熒光強度-粘度對數(shù)擬合曲線Fig.4 Optical images,emission spectra and fitting curves of logarithm of emission intensity-viscosity of Ir1 and Ir2 in the systems with different viscosities

2.3 對粘度的熒光壽命響應(yīng)

Ir1和Ir2在不同甘油-水組分溶劑中的熒光壽命(τ)如圖5所示，隨著溶劑粘度的增加，探針的熒光壽命顯著延長，Ir1的熒光壽命從1.02 μs增大到3.19 μs，Ir2的熒光壽命從 0.27 μs增大到 4.47 μs，其變化幅度比文獻(xiàn)報道中的粘度探針更大[16]。

圖5 Ir1和Ir2在不同粘度體系中的熒光壽命圖譜以及壽命-粘度的對數(shù)擬合曲線Fig.5 Lifetime spectra and fitting curves of logarithm of lifetime-viscosity of Ir1 and Ir2 in the systems with different viscosities

2.4 不同條件的響應(yīng)情況

使用465 nm的光源持續(xù)照射甘油體積分?jǐn)?shù)為0%和80%的甘油-水體系的溶液30 min，結(jié)果如圖6a所示，可見熒光強度幾乎沒有變化，表明探針在體外溶液中的光穩(wěn)定性良好。同時，在不同pH值、不同粘度體系中，探針的熒光強度也基本沒有變化，證明探針對粘度的檢測具有pH穩(wěn)定性(圖6b)。但隨著溫度的增加(從20℃升高到45℃)，配合物在不同粘度環(huán)境中的熒光強度呈下降的趨勢(圖6c)，這是由于在高溫條件下，體系粘度降低導(dǎo)致熒光強度也隨溫度的升高而降低，該結(jié)果與文獻(xiàn)的報道相吻合[36]。

圖6 不同粘度體系中Ir1和Ir2的熒光強度隨光照時間、溫度和pH的變化Fig.6 Fluorescence intensity changes of Ir1 and Ir2 as function of irradiation time,temperature,pH in the systems with different viscosities

2.5 細(xì)胞共聚焦顯微成像

使用共聚焦激光掃描顯微鏡研究Ir1和Ir2在Hep-G2細(xì)胞中的定位情況。如圖7所示，共染實驗表明，配合物Ir1和Ir2能夠快速進入活的Hep-G2細(xì)胞中并能清晰地顯示出較強熒光，同時，Ir1和Ir2在Hep-G2細(xì)胞中都與線粒體染料MitoTrackers?Red表現(xiàn)出高度重疊，共染系數(shù)分別達(dá)到了87.5%與79.6%。然而，Ir1和Ir2與溶酶體染料LysoTrackers?Red僅有少量重疊，由此得出結(jié)論：Ir1和Ir2可以特異性地定位于Hep-G2細(xì)胞線粒體中。

圖7 Ir1或Ir2與細(xì)胞器染料(a)MitoTrackers? Red和(b)LysoTrackers? Red共孵育Hep-G2細(xì)胞的激光共聚焦圖像Fig.7 Cellular colocalization microscopy images of Hep-G2 cells incubated with Ir1 or Ir2 and(a)MitoTrackers? Red and(b)LysoTrackers? Red

2.6 細(xì)胞攝取

進一步采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)定量研究Hep-G2細(xì)胞對Ir1和Ir2的攝取和配合物在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。分別用10 μmol·L-1的配合物Ir1和Ir2孵育細(xì)胞1 h后，從細(xì)胞中提取出線粒體，經(jīng)ICP-MS測試，結(jié)果如圖8所示，Ir1和Ir2在線粒體中的相對含量均非常高，分別為71.4%和78.5%，表明大部分配合物主要聚集在線粒體中，這與上述細(xì)胞共定位實驗結(jié)果相符合。

圖8 ICP-MS定量測定的Ir1和Ir2在每個Hep-G2細(xì)胞中的含量Fig.8 ICP-MS quantitative determination of content of Ir1 and Ir2 in each Hep-G2 cell

2.7 對細(xì)胞的光、暗毒性測試

采用MTT法檢測Ir1和Ir2對各種細(xì)胞的光、暗毒性。如表1所示，在黑暗條件下，Ir1和Ir2孵育的Hep-G2細(xì)胞的 IC50均很高(IC50＞100 μmol·L-1)，這表明在黑暗條件下，探針I(yè)r1和Ir2對于Hep-G2細(xì)胞的生物毒性很小，能夠用于活細(xì)胞的粘度進行成像。然而，在465 nm光源持續(xù)照射30 min后，Ir1和Ir2對Hep-G2細(xì)胞和A549細(xì)胞的IC50值分別達(dá)到0.75 和 1.24 μmol·L-1。我們采用光療指數(shù) PI值(IC50,dark/IC50,light)來衡量藥物對細(xì)胞的光毒性，可以發(fā)現(xiàn)，Ir1對Hep-G2細(xì)胞和A549細(xì)胞的PI值分別達(dá)到了205和148，這和已報道的光敏劑相比具有相當(dāng)?shù)墓庵委熜Ч鸞4]。同時，Ir1和Ir2對相應(yīng)的正常細(xì)胞的光毒性都較小，這可能是癌細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)粘度比正常細(xì)胞中的粘度高[37]，導(dǎo)致Ir1和Ir2在癌細(xì)胞中的熒光更強。我們的實驗結(jié)果也證明了配合物Ir1和Ir2在肝腫瘤細(xì)胞Hep-G2中的熒光更強，而在肝正常細(xì)胞LO2中的熒光更弱(圖9)。更強的熒光的光敏劑可能會導(dǎo)致產(chǎn)生單線態(tài)氧更多，因此對癌細(xì)胞的光毒性更強而對正常細(xì)胞的光毒性較弱。

表1 Ir1和Ir2對不同細(xì)胞的光/暗毒性Table 1 Photo/dark toxicity of Ir1 and Ir2 towards different cells

圖9 Ir1或Ir2在肝腫瘤細(xì)胞Hep-G2和肝正常細(xì)胞LO2中的共聚焦圖像(a、b)以及它們熒光強度的相對值(c)Fig.9 Cellular microscopy images(a,b)and luminescent intensities(c)of Hep-GG2 and LO2 cells incubated with Ir1 or Ir2

2.8 EPR檢測1O2

對于光敏劑尤其是金屬配合物類光敏劑而言，1O2是其殺死腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵性物質(zhì)。我們首先通過電子順磁共振儀檢測配合物Ir1和Ir2在光照下產(chǎn)生1O2的情況，采用2，2，6，6-四甲基哌啶(TEMP)作為1O2的捕獲劑，每隔5 min光照一次(465 nm，50 mW·cm-2)。如圖10所示，在沒有光照時(0 min)并沒有檢測到1O2的特征峰信號，而在開啟光照后，在3 480～3 530 G范圍內(nèi)出現(xiàn)了相對強度為1∶1∶1的1O2的特征峰信號，并且信號強度隨光照時間的增加而增強，表明銥配合物Ir1和Ir2在光照下與氧氣作用最終產(chǎn)生了1O2。

圖10 Ir1和Ir2在光照下產(chǎn)生1O2的EPR譜圖Fig.10 EPR spectra of1O2produced by Ir1 and Ir2 upon light irradiation

在此基礎(chǔ)上，為了進一步研究Ir1和Ir2的1O2產(chǎn)生效率，我們利用RNO檢測法測定了Ir1和Ir2的1O2量子產(chǎn)率，RNO檢測法的基本原理如下：1O2與體系中的組氨酸(His)反應(yīng)產(chǎn)生中間產(chǎn)物HisO2，此中間產(chǎn)物會與RNO反應(yīng)，消耗體系中的RNO，而RNO含量的減少可通過紫外可見分光光度計進行定量檢測，記錄其在440 nm處特征吸收峰強度的衰減程度能夠間接測得1O2的含量，從而得出1O2量子產(chǎn)率。如圖11所示，隨著光照時間的增加，RNO特征峰強度的衰減量不斷增大，表明越來越多的1O2產(chǎn)生，我們通過衰減斜率來衡量配合物產(chǎn)生1O2的效率，并與[Ru(bpy)3]2+(Φref,1O2=0.22)進行對照[38]，發(fā)現(xiàn)1O2的產(chǎn)生效率大小順序為Ir1＞[Ru(bpy)3]2+＞Ir2，并且體系粘度越大，其1O2產(chǎn)生效率越大。如表2所示，經(jīng)過進一步計算可以得出Ir1和Ir2的1O2量子產(chǎn)率分別為0.32和0.16。該實驗結(jié)果也間接證明了Ir1和Ir2在高粘度的癌細(xì)胞中能產(chǎn)生更多1O2，從而光毒性更大。

圖11 Ir1和Ir2在光照下產(chǎn)生1O2的量子產(chǎn)率Fig.11 Quantum yield of producing1O2by Ir1 and Ir2 upon light irradiation

表2 Ir1和Ir2的1O2量子產(chǎn)率Table 2 1O2quantum efficiency of Ir1 and Ir2

2.9 細(xì)胞中1O2的檢測

Ir1和Ir2在溶液中能夠產(chǎn)生1O2使其有望成為光敏劑，因此，我們進一步采用商用1O2探針SOSG(single oxygen sensor green)檢測細(xì)胞中1O2產(chǎn)生情況。相比于其他活性氧探針，SOSG不會與其他活性氧如羥基自由基、超氧陰離子和一氧化氮等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且可以特異性地與1O2進行結(jié)合，是1O2的專一性檢測探針。SOSG未與1O2反應(yīng)前，呈現(xiàn)出微弱的綠色熒光，而與1O2反應(yīng)后，其產(chǎn)物呈現(xiàn)強綠色熒光。如圖12所示，可以清晰地觀察到，黑暗時沒有觀察到SOSG的綠色熒光，表明此時沒有1O2產(chǎn)生，而光照一定時間后細(xì)胞中呈現(xiàn)出了明顯的綠色熒光，表明細(xì)胞中的Ir1和Ir2在光照下產(chǎn)生了大量的1O2。同時，對于預(yù)先加入了NaN3(1O2清除劑)的對照組，其綠色熒光大部分被猝滅，進一步表明Ir1和Ir2在細(xì)胞中產(chǎn)生了1O2。經(jīng)過ZEN軟件分析，可以計算出熒光圖中的平均熒光強度，配合物孵育下的光照組細(xì)胞中SOSG的強度明顯高于黑暗組的，這進一步表明在光照條件下，配合物在細(xì)胞中高效地產(chǎn)生了1O2。

圖12 在黑暗下和藍(lán)光照射5 min后，Ir1或Ir2(5 μmol·L-1,1 h)與1O2探針SOSG(5 μmol·L-1,30 min)共孵育Hep-G2細(xì)胞及加入NaN3(5 mmol·L-1,1 h)前后的激光共聚焦圖像Fig.12 Confocal microscopy imaging of Hep-G2 cells colabeled with Ir1 or Ir2(5 μmol·L-1,1 h)and1O2probe SOSG(5 μmol·L-1,30 min)in the absence or presence of NaN3(5 mmol·L-1,1 h)in the dark and under blue light irradiation for 5 min

3 結(jié) 論

設(shè)計、合成了2種新穎的銥配合物Ir1和Ir2，并系統(tǒng)研究了Ir1和Ir2分子的熒光強度和熒光壽命與體系粘度之間的關(guān)系。結(jié)果表明，探針的熒光強度和熒光壽命均隨著體系粘度的增大而顯著增大，這是由于Ir1和Ir2結(jié)構(gòu)中的單鍵在水溶液中可以自由旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致熒光猝滅；而在粘度較大時，旋轉(zhuǎn)受阻，從而使熒光上升和熒光壽命延長，而具有強熒光特性的光敏劑是光動力治療的前提條件。有趣的是，配合物還可以高效地靶向聚集于細(xì)胞中的線粒體，作為優(yōu)異的粘度探針對線粒體內(nèi)粘度進行成像檢測。重要的是，在光照條件下，2種配合物能很好地引發(fā)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，其IC50值均處于極低的水平，2種分子均具有非常好的光動力治療效果。因此，Ir1和Ir2有望開發(fā)成為聯(lián)合檢測細(xì)胞器內(nèi)粘度和高效光動力治療的金屬藥物。

致謝：感謝深圳大學(xué)測試中心提供的儀器平臺。