裴 飛，王雪冬，李寶龍，唐 強(qiáng)，朱路文

1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001；

2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院暨康復(fù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150001

* 通信作者：朱路文，E-mail：zhuluwen1983@126.com

缺血性腦卒中是神經(jīng)功能障礙的主要原因，給患者、護(hù)理人員，以及社會帶來重大負(fù)擔(dān)。 對于缺血性腦卒中主要采用藥物以及針灸、推拿、運(yùn)動等康復(fù)手段治療，尤其是運(yùn)動康復(fù)療法在臨床中對于缺血性腦卒中有很好的治療效果。 朱路文等［1］研究表明腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的加快可能通過針康法（頭穴叢刺長留針結(jié)合現(xiàn)代康復(fù)方法）上調(diào)缺血腦組織血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)而實現(xiàn)；孫國劍等［2］也發(fā)現(xiàn)電針療法與運(yùn)動訓(xùn)練都能夠提高缺血再灌注大鼠大腦皮層中VEGF mRNA 表達(dá)量，而且兩者結(jié)合效果更好。 運(yùn)動預(yù)處理目前也是研究的熱點(diǎn)，動物研究表明，運(yùn)動預(yù)處理對腦缺血有益的作用，包括提高存活率、減輕氧化損傷、改善腦血流量和維持神經(jīng)血管完整性［3-5］，但是沒有研究證明運(yùn)動預(yù)處理對于腦缺血再灌注大鼠VEGF、神經(jīng)元核心抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）的影響。 因此，本實驗欲探討運(yùn)動預(yù)處理對于腦缺血再灌注大鼠VEGF、NeuN 的影響，從而為腦卒中的預(yù)防機(jī)制提供動物實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

1.1.1動物 健康清潔級Sprague-Dawley 雄性大鼠96 只，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物許可證號為SCXK（遼）2015-0001，體質(zhì)量（220±20） g，月齡3 個月。 飼養(yǎng)條件：SPF 級實驗中心，安靜環(huán)境、室溫20～25 ℃，濕度為50%～60%，清潔級飼養(yǎng)，12 h 明暗光照交替，晝夜循環(huán)，通風(fēng)良好，大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，每日固定點(diǎn)喂食。

1.1.2 分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、運(yùn)假組（運(yùn)動預(yù)處理與假手術(shù)組）和運(yùn)模組（運(yùn)動預(yù)處理與模型組），每組24 只。 每組按再灌注24 h、3 d 后又分為2 個亞組，每個亞組12 只。實驗所有大鼠處置方法均符合小動物倫理。

1.2 主要器材和試劑

動物實驗跑臺（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；CX41RF 顯微鏡（OLYMPUS 公司）；HM525NX U冷凍切片機(jī)和Excelsior AS 自動組織脫水機(jī)（上海賽默飛世爾儀器有限公司）；WB 系統(tǒng)（BIO-RAD 公司）；VEGF（Affinity Biosciences，Ab-AF5131）；NeuN（Affinity Biosciences，Ab-DF6145）；二抗：山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZB-2301）；Actin（bioss，bs-0061R）；4%多聚甲醛PBS 溶液（安徽雷根生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1模型制備 模型組和運(yùn)模組大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，采用Longa 改良線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，2 h 后將線栓緩慢拔出至頸總動脈主干分叉處。6 h 后采用改良的Bederson 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能初步評分，即：①0 分，無神經(jīng)功能缺失體征；②1 分，提尾時損傷對側(cè)前肢屈曲；③2 分，前肢屈曲及對側(cè)抵抗力下降；④3 分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；⑤4 分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及意識障礙。 評分為1～3 分的大鼠納入本次實驗。 假手術(shù)組和運(yùn)假組大鼠造模方法同上，但線栓僅從頸總動脈插入約10 mm 以后即拔出，不能阻塞大腦中動脈血流供應(yīng)。

1.3.2處理方法 模型組與假手術(shù)組不給予任何治療。 運(yùn)模組和運(yùn)假組給予跑臺訓(xùn)練，先給予適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，速度10 m／min，每天訓(xùn)練20 min，持續(xù)3 d；正式性跑臺訓(xùn)練：速度15 m／min，每天訓(xùn)練30 min，坡度為0，每周訓(xùn)練6 d，連續(xù)訓(xùn)練3 周。 運(yùn)模組和運(yùn)假組正式訓(xùn)練3 周以后，4 組大鼠同時進(jìn)行造模處理，分別在再灌注24 h、3 d 后對指標(biāo)進(jìn)行觀察及取材。

1.4 檢測指標(biāo)及取材

1.4.1改良神經(jīng)功能評分（modified neurologic severity score，mNSS） 參照文獻(xiàn)［6］，分別在再灌注24 h、3 d 后進(jìn)行檢測，包括：①運(yùn)動測試：包括提尾測試和行走測試；②感覺測試：包括放置測試和本體感覺測試；③平衡木測試；④反射消失和異常運(yùn)動：包括耳廓反射，角膜反射，驚恐反射，癲癇、肌陣攣、肌張力異常4 個方面評估大鼠神經(jīng)功能缺損程度，總分越高表明損傷程度越重。

1.4.2取材及標(biāo)本處理 再灌注24 h、3 d 以后，每組取6 只大鼠，大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，從心尖以4%多聚甲醛磷酸鹽（PBS）緩沖液（pH＝7.4，4 ℃）進(jìn)行緩慢灌注后快速斷頭取腦。 分離缺血側(cè)腦組織，然后放入4%多聚甲醛PBS 溶液中固定48 h 后，取視交叉和其后4 mm 處兩點(diǎn)，切取腦冠狀薄片，厚度約4 mm，脫水，常規(guī)石蠟包埋。

再灌注24 h、3 d 以后，對各組其余的6 只大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，快速取缺血側(cè)鮮腦皮層，置于液氮中快速降溫，然后迅速放入-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3免疫組化染色檢測VEGF 表達(dá)情況 將每組大鼠腦組織石蠟切片，切片厚度為3～5 μm 粘附在防脫玻片上，56～60 ℃烤片2 h。 脫蠟至水，高溫抗原修復(fù)，PBS 沖洗3 min×3 次，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，PBS 沖洗3 min×3 次，滴加山羊血清封閉液，37 ℃30 min。 加VEGF 一抗（1∶100），4 ℃過夜。恢復(fù)至室溫后，PBS 沖洗3 min×3 次。滴加即用型山羊抗兔二抗，室溫孵育20 min，PBS 沖洗3 min×3 次，DBA 顯色5～10 s，水洗終止；蘇木素復(fù)染20 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡在10×40倍下對視野中VEGF 陽性率表達(dá)觀察，Image-Pro Plus 軟件行圖像分析，計算目的蛋白表達(dá)面積與組織總面積的比率，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4.4Western blot 測定NeuN 蛋白表達(dá)水平 將腦組織從-80 ℃冰箱中取出，按每0.1 g 腦組織加1 mL 組織蛋白裂解液至玻璃勻漿器勻漿好的組織當(dāng)中，充分混勻后，采用去垢劑兼容型考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒定量檢測各標(biāo)本總蛋白濃度。 每組取20 μg 蛋白裂解液制樣，①電泳：包括制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，本次實驗濃縮膠濃度5%，分離膠濃度12%，灌膠，上樣。 ②蛋白電泳：將電泳儀調(diào)至恒壓100 V 后開始電泳，待指示劑進(jìn)入分離膠后，調(diào)整電壓120 V 繼續(xù)電泳，待藍(lán)色指示條接近凝膠底部后停止電泳。 ③轉(zhuǎn)膜：將凝膠按照陽極、海綿墊、濾紙、PVDF 膜、凝膠、濾紙、海綿墊、陰極的順序夾入轉(zhuǎn)膜夾中，然后將轉(zhuǎn)膜夾按照正負(fù)極裝配到轉(zhuǎn)膜槽中，連接好正負(fù)極，將電泳儀調(diào)至恒流200 mA 轉(zhuǎn)膜2 h，此時的蛋白已從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。④封閉：將有目的蛋白的PVDF 膜浸泡在TBST 配制的5%脫脂牛奶中，室溫下在垂直脫色搖床上封閉1 h。相繼加NeuN 一抗（1∶500）、二抗（1∶5 000）孵育進(jìn)行免疫反應(yīng)，取出PVDF 膜浸入PBST 中，搖床搖動10 min，重復(fù)3 次，加ECL 發(fā)光液，顯色曝光。 結(jié)果采用Quantity One 圖像分析軟件進(jìn)行定量分析等量的樣品蛋白灰度值，以各組NeuN 與內(nèi)參Actin 灰度比值即為相對灰度，再除以假手術(shù)組相對灰度作為統(tǒng)計指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。 數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布采用（±s）表示，多組的組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較在方差齊性的情況下用LSD-t法進(jìn)行后效檢驗，方差不齊的情況下用Tamhane'sT2 方法進(jìn)行事后檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評估

假手術(shù)組和運(yùn)假組均未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。 與模型組比較，運(yùn)模組在再灌注24 h 后神經(jīng)功能缺損評分降低（P＜0.05）；與模型組比較，運(yùn)模組在再灌注3 d 后神經(jīng)功能缺損評分降低（P＜0.05）。評分越低，損傷程度越輕。 見表1。

表1 4 組大鼠不同時間mNSS 評分比較（±s） 分Table 1 Comparison of mNSS scores in four groups of rats at different times （±s）Scores

表1 4 組大鼠不同時間mNSS 評分比較（±s） 分Table 1 Comparison of mNSS scores in four groups of rats at different times （±s）Scores

注：與模型組比較，1） P＜0.05。Note: Compared with the model group, 1) P＜0.05.

組別假手術(shù)組運(yùn) 假 組模 型 組運(yùn) 模 組n 再灌注24 h 再灌注3 d 12 12 12 12 00 00 12.50±0.47 11.50±0.381）9.50±0.57 7.25±0.351）

2.2 免疫組化染色VEGF 表達(dá)

腦組織半暗帶區(qū)，VEGF 免疫組織化學(xué)染色中的棕褐色或棕黃色顆粒沉著在細(xì)胞漿和包膜及細(xì)胞周邊區(qū)，在腦組織的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均可表達(dá)。 再灌注24 h 后，假手術(shù)組可見少量的血管內(nèi)皮生長因子VEGF 表達(dá)，陽性細(xì)胞胞體小，突起細(xì)，陽性率較低。 見表2、圖1 和圖2。

表2 4 組大鼠不同時間VEGF 表達(dá)比例%Table 2 The ratio of VEGF expression in four groups of rats at different times%

圖1 4 組腦缺血再灌注24 h 后缺血側(cè)VEGF 表達(dá)（×400）Figure 1 VEGF expression in four groups on ischemic side 24 hours after cerebral ischemia reperfusion （×400）

圖2 4 組腦缺血再灌注3 d 后缺血側(cè)VEGF 表達(dá)（×400）Figure 2 VEGF expression in four groups on ischemic side 3 days after cerebral ischemia reperfusion （×400）

2.3 NeuN 蛋白的表達(dá)水平

NeuN 蛋白的Western blot 結(jié)果顯示，再灌注24 h后運(yùn)模組與模型組都有下降，運(yùn)模組下降程度相比模型組較少；再灌注3 d 后都有升高，運(yùn)模組升高程度相比模型組較多。 再灌注24 h 和3 d 后，運(yùn)模組分別與假手術(shù)組、模型組、運(yùn)假組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見圖3 和圖4。

圖3 4 組大鼠腦缺血周邊區(qū)NeuN 蛋白表達(dá)Figure 3 NeuN protein expression in the peripheral area of cerebral ischemia in four groups of rats

3 討 論

在“針康同步、動態(tài)治療、整體康復(fù)”的腦卒中康復(fù)思想“針康法”指導(dǎo)下［7］，本課題組前期研究做了大量關(guān)于動物實驗以及臨床研究［8］，表明針康法促進(jìn)缺血區(qū)周圍皮質(zhì)突觸可塑，降低腦缺血后神經(jīng)元的損傷，加速神 經(jīng)功能 重建［9］；抑制神 經(jīng)元凋亡［10］，保護(hù)神經(jīng)元；促進(jìn)血管新生［11-12］；降低炎性損傷程度［13］等。 總之，針康法對微血管、神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)不是單一的，而是整體上調(diào)控，從而促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)血管單元功能重塑［14］。 另外，針康法也強(qiáng)調(diào)腦卒中預(yù)防的重要性，研究表明運(yùn)功預(yù)處理可改善腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性，具有腦保護(hù)作用［15］；電針預(yù)處理降低炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡［16］，炎癥反應(yīng)在缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色，參與病理損傷的全過程［17］。

圖4 4 組大鼠腦缺血周邊區(qū)NeuN 蛋白灰度值比較Figure 4 Comparison of the gray value of NeuN protein in the cerebral ischemic peripheral area in four groups of rats

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注3 d 后VEGF表達(dá)更多，3 d 時運(yùn)模組在缺血周邊區(qū)的表達(dá)明顯高于模型組、運(yùn)假組和假手術(shù)組，這一結(jié)果提示運(yùn)動預(yù)處理促進(jìn)了VEGF 表達(dá)，腦缺血再灌注以后也會促進(jìn)VEGF 表達(dá)，而同樣在腦缺血再灌注的條件下，運(yùn)動預(yù)處理組的大鼠VEGF 表達(dá)更多，神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)更低；腦缺血再灌注3 d 以后NeuN 蛋白表達(dá)明顯增多，神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)也更低。 在實驗中也發(fā)現(xiàn)運(yùn)假組在腦缺血再灌注3 d 后，VEGF、NeuN 蛋白表達(dá)都有增高，考慮主要是運(yùn)動預(yù)處理促進(jìn)了相關(guān)蛋白表達(dá)。

目前對于運(yùn)動預(yù)處理的作用機(jī)制有很多研究，其主要在于在反復(fù)的運(yùn)動中，出現(xiàn)短暫的、輕微的腦缺血可有效誘導(dǎo)缺血／缺氧耐受，導(dǎo)致具有調(diào)節(jié)神經(jīng)環(huán)境、再生過程、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等作用，另外也有圍繞血流動力學(xué)和血管內(nèi)皮功能，誘導(dǎo)VEGF 信號［18］。 VEGF 為血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移以及血管通透性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［19］。 有文獻(xiàn)報道，VEGF 及受體是血管生成中特異、有效的作用元素，在血管生成中具有重要的意義，而VEGF 表達(dá)的主要刺激因素為血流量增加、內(nèi)皮剪應(yīng)力增加、氧化代謝增強(qiáng)等［20］，VEGF 在運(yùn)動誘導(dǎo)血管生成和增加腦側(cè)支循環(huán)中的作用需要反復(fù)進(jìn)行中、高強(qiáng)度的運(yùn)動訓(xùn)練［21］。另有研究報道，F(xiàn)c-axatilin 通過調(diào)節(jié)下游信號通路減弱VEGF 誘導(dǎo)的內(nèi)皮通透性，這可能有助于其對缺血性腦血管滲漏的保護(hù)作用［22］。 基質(zhì)金屬蛋白酶-9、VEGF 參與了腦梗死的發(fā)生、發(fā)展過程，在缺血性腦卒中其具有重要的臨床意義［23-24］。

NeuN 是一種核蛋白，在成熟神經(jīng)元胞核中表達(dá)，是一種特異的神經(jīng)元標(biāo)志物，神經(jīng)元的成熟與NeuN 的表達(dá)量成正相關(guān)性，因此作為神經(jīng)元的標(biāo)記物［25］。金媛媛等［26］觀察到腦缺血后，缺血區(qū)NeuN 陽性細(xì)胞減少。 因此，本研究采用中等強(qiáng)度跑步訓(xùn)練，觀察運(yùn)動預(yù)處理對于腦缺血再灌注后VEGF、NeuN的影響。

臨床研究表明，運(yùn)動訓(xùn)練可以提高老年人的腦血管反應(yīng)性，增加健康老年人大腦中的小血管數(shù)目，并減少血液流變特性的異常［27-28］。 糾正心腦疾患危險因素的重要方法即為運(yùn)動療法，其在心腦血管疾病一級和二級預(yù)防中起著重要作用［29］。 缺血性腦卒中的危險因素有效管理對于降低腦卒中的復(fù)發(fā)率是很重要的［30］，社會支持是患者應(yīng)對疾病的有效資源之一［31］，然而目前公眾對健康生活方式的認(rèn)識和對危險因素的控制仍然不是最理想的［32］。 本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注前給予運(yùn)動預(yù)處理可減少腦缺血再灌注以后的腦損傷程度，通過增強(qiáng)VEGF、NeuN 蛋白的表達(dá)，從而改善感覺運(yùn)動功能障礙和運(yùn)動行為。 本實驗進(jìn)一步證明臨床中運(yùn)動預(yù)處理對于腦卒中的預(yù)防機(jī)制，從而提供具有腦卒中風(fēng)險人群預(yù)防的依據(jù)。