張紅娜 王衛(wèi)平 解晶晶 姚 靜 雷瑞芳 衛(wèi) 婷 張 妍

（韓城市花椒研究所，陜西 韓城 715400）

韓城花椒是調(diào)味佳品和保健良藥，主要用于干制以及深加工,全市有花椒加工企業(yè)30多家，先后研發(fā)出7類35個花椒系列產(chǎn)品，獲得相關(guān)專利100多項，建有全國唯一的國家花椒產(chǎn)業(yè)園區(qū)和多個花椒專業(yè)貿(mào)易市場，擁有一支2000多人的花椒專業(yè)銷售隊伍，在北京、重慶、四川等地設有花椒直銷網(wǎng)點100多個。產(chǎn)品出口東南亞及歐美等地。 但當前花椒生產(chǎn)仍存在一些突出的問題, 如 :品種雜亂、良種化程度低、良種選育進程緩慢。因此，韓城市花椒研究所通過3年花椒組織快繁試驗，總結(jié)出一套可行的組培快繁育苗體系。

1.實驗材料

本次實驗所用的材料為韓城市花椒研究所花椒科技服務中心種質(zhì)資源圃的韓城大紅袍花椒1年生的植株。

2.研究方法

2.1 外植體的選擇

選取韓城大紅袍花椒的頂芽和腋芽。

2.2 外植體的消毒處理

取生長健壯的頂芽和腋芽，將表面的雜物清理干凈，在流動的自來水下沖洗30min，然后將沖洗過的材料置于無菌的廣口瓶中，用體積比75%的酒精表面滅菌30s后，用2%～5%的次氯酸鈉滅菌1min～3min，再用培養(yǎng)瓶中的無菌水依次浸泡沖洗3次，每次搖晃1min以上，最后置于滅菌過的濾紙瀝干，將基部切削后接種在培養(yǎng)基內(nèi)。

將以上滅菌好的外植體材料，接種在WPM的基本培養(yǎng)基上，在20天以后統(tǒng)計污染率，30天以后統(tǒng)計死亡率。

污染率=（污染個數(shù)/外植體個數(shù)）×100%

死亡率=（死亡個數(shù)/外植體個數(shù)）×100%

2.3 培養(yǎng)條件

在實驗中，基本培養(yǎng)基使用MS和WPM，在不同的培養(yǎng)階段使用不同濃度的蔗糖和激素，凝固劑使用瓊脂，強度為1400g/cm2,使用量為5.2g/L,pH值為5.8-6.0，培養(yǎng)室溫度為25℃±2℃，培養(yǎng)室相對濕度為50%±10%，光照強度為2400lux～2700lux,光照時間為14h/d,培養(yǎng)基滅菌消毒的物理指標為120℃～122℃，0.11MPa～0.13MPa持續(xù)25min。

2.4 初代培養(yǎng)

2.4.1 不同基本培養(yǎng)基對誘導不定芽的影響

取韓城大紅袍花椒處理成活的外植體接種在分裂素為1.0mg/L的6-BA和0.2mg/L的GA3的激素培養(yǎng)基中,選用不同的基本培養(yǎng)基進行篩選，每組培養(yǎng)基接種20株外植體（每瓶接種1株外植體），重復3次，30天后統(tǒng)計出外植體的出芽率。

不定芽的出芽率=（長出不定芽的個數(shù)/外植體個數(shù)）×100%

表2 不同基本培養(yǎng)基

2.4.2 不同激素及濃度對誘導不定芽的影響

取韓城大紅袍花椒處理成活的外植體接種在基本培養(yǎng)基WPM中,選用不同的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA在不同的濃度上進行篩選，每組培養(yǎng)基接種20個外植體（每瓶接種1個外植體），重復3次，30天后統(tǒng)計出外植體的出芽率。

表3 外植體處理的激素水平

B3 WPM 30 0．6 0．2 0 5．2 6．0 B4 WPM 30 0．8 0．2 0 5．2 6．0 B5 WPM 30 1．0 0．2 0 5．2 6．0 B6 WPM 30 1．2 0．2 0 5．2 6．0 B7 WPM 30 1．4 0．2 0 5．2 6．0 B8 WPM 30 1．6 0．2 0 5．2 6．0 B9 WPM 30 1．8 0．2 0 5．2 6．0 B10 WPM 30 2．0 0．2 0 5．2 6．0 C1 WPM 30 1．0 0．2 0．1 5．2 6．0 C2 WPM 30 1．0 0．2 0．2 5．2 6．0 C3 WPM 30 1．0 0．2 0．3 5．2 6．0 C4 WPM 30 1．0 0．2 0．4 5．2 6．0 C5 WPM 30 1．0 0．2 0．5 5．2 6．0

2.5 增殖培養(yǎng)

經(jīng)過外植體誘導培養(yǎng)形成不定芽，再后期主要的是將不定芽進行繁殖獲得大量瓶苗，將誘導的不定芽作為培養(yǎng)材料篩選出最佳增殖培養(yǎng)基。

2.5.1 不同激素及濃度對不定芽增殖的影響

將誘導的不定芽接種在基本培養(yǎng)基為WPM,選用植物生長調(diào)節(jié)劑NAA0.1mg/L和6-BA的不同濃度，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶接種5株不定芽，重復3次，45天后統(tǒng)計出不定芽的增殖系數(shù)。

不定芽的增殖系數(shù)=長出不定芽的個數(shù)/接種不定芽的個數(shù)

表4 不定芽增殖培養(yǎng)不同激素水平

2.6 壯苗生根培養(yǎng)

當不定芽增殖到一定的數(shù)量，在馴化煉苗之前需要進行瓶苗的壯苗生根階段，將增殖的不定芽作為培養(yǎng)材料篩選出最佳的壯苗生根培養(yǎng)基。

2.6.1 不同基本培養(yǎng)對壯苗生根培養(yǎng)的影響

取增殖不定芽接種在生長素為1.0mg/L的IAA和生長調(diào)節(jié)劑0.01mg/L的NAA的激素培養(yǎng)基中,選用不同的基本培養(yǎng)基上進行篩選，每瓶接種10個不定芽，重復3次，30天后統(tǒng)計出生根率。

生根率=長出根的個數(shù)/接種的個數(shù)×100%

表5 壯苗生根培養(yǎng)不同基本培養(yǎng)基

2.6.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑使用不同的濃度對壯苗生根培養(yǎng)的影響

取增殖不定芽接種在基本培養(yǎng)基為1/2MS,選用不同的植物生長調(diào)節(jié)劑IBA和NAA在不同的濃度上進行篩選，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶接種10個不定芽，重復3次，30天后統(tǒng)計出不定芽的生根率。

生根率=長出根的個數(shù)/接種的個數(shù)×100%

表6 壯苗生根培養(yǎng)不同的激素水平

3.結(jié)果與分析

3.1 外植體的消毒處理

分別對韓城大紅袍花椒的頂芽和腋芽使用75%的酒精30s后，再按表1所示的消毒處理方法進行操作。

表1 次氯酸鈉不同的濃度不同的消毒時間

由表7數(shù)據(jù)分析可知，從取材部位的選擇上，腋芽的綜合成功率要略高于頂芽；從次氯酸鈉的使用濃度對比上，選用2% 的次氯酸鈉處理外植體均出現(xiàn)污染現(xiàn)象，選用2% 的次氯酸鈉相比選用4%和5%兩個次氯酸鈉的濃度處理外植體成功率最低，選用4%次氯酸鈉濃度相比較選用5%次氯酸鈉濃度處理腋芽成功率略高；從外植體處理時間上分析，數(shù)據(jù)參差不齊，綜合分析，使用4%的次氯酸鈉濃度處理腋芽2分鐘成功率最高。

表7 韓城大紅袍花椒不同的取材部位和次氯酸鈉不同的濃度不同的消毒時間對外植體的影響

3.2 不同基本培養(yǎng)基對誘導不定芽的影響

由表8數(shù)據(jù)分析可知，選用基本培養(yǎng)基為WPM，蔗糖濃度為30g/L,瓊脂5.2g/L的基本培養(yǎng)基對外植體誘導不定芽最佳。

表8 不同基本培養(yǎng)基對韓城大紅袍花椒外植體誘導不定芽的影響

3.3 不同激素及濃度對誘導不定芽的影響

由表9數(shù)據(jù)分析可知，6-BA在0.2mg/L至1.6mg/L的范圍內(nèi)，隨著6-BA使用濃度的提升，不定芽的誘導率逐漸上升，6-BA在1.6mg/L至2.0mg/L的范圍內(nèi)，隨著6-BA使用濃度的提升，不定芽的誘導率逐漸下降，出現(xiàn)愈傷組織較多，NAA在0.1mg/L至0.5mg/L的范圍內(nèi)，隨著NAA使用濃度的提升，不定芽的誘導率逐漸下降，出現(xiàn)愈傷組織較多，綜合分析所得當選用6-BA1.6mg/L和NAA0.1mg/L對外植體誘導不定芽最佳。

表9 不同激素水平對韓城大紅袍花椒外植體誘導不定芽的影響

3.4 不同激素及濃度對不定芽增殖的影響

由表10數(shù)據(jù)分析可知，當選用6-BA1.0mg/L對不定芽的增殖培養(yǎng)的擴繁數(shù)量最多。

表10 不同激素水平對韓城大紅袍花椒不定芽增殖的影響

3.5 不同基本培養(yǎng)對壯苗生根培養(yǎng)的影響

由表11數(shù)據(jù)分析可知，當選用1/2MS為基本培養(yǎng)基對壯苗生根培養(yǎng)最佳。

表11 不同基本培養(yǎng)基對韓城大紅袍花椒壯苗生根培養(yǎng)的影響

3.6 不同激素濃度水平對壯苗生根培養(yǎng)的影響

由表12數(shù)據(jù)分析可知，IAA在0.2mg/L至1.0mg/L的范圍內(nèi)，隨著IAA使用濃度的提升，生根率逐漸上升，IAA在1.0mg/L至2.0mg/L的范圍內(nèi)，隨著IAA使用濃度的提升，生根率逐漸下降，NAA在0.01mg/L至0.05mg/L的范圍內(nèi)，隨著NAA使用濃度的提升，生根率逐漸下降，綜合分析所得當選用IAA1.0mg/L和NAA0.01mg/L對壯苗生根最佳。

表12 不同的激素水平對韓城大紅袍花椒壯苗生根培養(yǎng)的影響

4.結(jié)論

4.1 在韓城大紅袍花椒外植體的取材部位選擇上以春季萌發(fā)的腋芽最優(yōu)。

4.2 在外植體的消毒處理的方法中，“將腋芽表面雜物物理清理干凈→流動的自來水下沖洗30min→體積比75%的酒精表面滅菌30s→4%的次氯酸鈉滅菌2min→無菌水依次浸泡沖洗3次，每次搖晃1min以上”的處理外植體的方法成功率最高。

4.3 在外植體誘導不定芽的培養(yǎng)過程中以WPM+6-BA1.6mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.2g/L+pH6.0作為培養(yǎng)基最佳。

4.4 在不定芽的增殖培養(yǎng)過程中以WPM+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.2g/L+pH5.8作為培養(yǎng)基最佳。

4.5 在生根壯苗的培養(yǎng)過程中1/2MS+IAA1.0mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5.2g/L+pH5.8作為培養(yǎng)基最佳。