劉倩, 李紀(jì)潮, 左應(yīng)梅, 楊天梅, 楊美權(quán), 張金渝

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所, 昆明 650051; 2.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院, 昆明 650500)

三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen]又名田七，為五加科人參屬多年生草本植物，其主根是我國(guó)名貴中藥材。有機(jī)覆蓋是用各種秸稈、凋落物、雜草、枝葉、鋸木屑、牲畜糞便、葦子、果殼等覆蓋耕作土壤地面的一種傳統(tǒng)土壤改良技術(shù)，對(duì)多種作物和中藥材栽培在提高產(chǎn)量和質(zhì)量、保持土壤溫度和水分、提高土壤養(yǎng)分等方面已有較為深入的研究。相關(guān)研究表明，覆蓋物覆蓋土壤表面后，引起土壤溫度、水分、土壤肥力、土壤物理性狀和結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而對(duì)其群落結(jié)構(gòu)和組成產(chǎn)生影響。有機(jī)覆蓋物覆蓋后，土壤微生物量和水溶性有機(jī)碳含量提高，稻殼覆蓋能促進(jìn)種植人參土壤益生菌的生長(zhǎng)，可用于人參根腐病的防治[1]。本課題組在前期田間調(diào)研中發(fā)現(xiàn)藥農(nóng)常在三七的土壤表面覆蓋松針或黃花蒿，對(duì)三七生長(zhǎng)和減少病害發(fā)生有積極作用，但其原因和機(jī)理尚不清楚，且三七的有機(jī)覆蓋栽培尚無具體深入研究。

目前，普遍認(rèn)為土壤微生物群落的組成與分布受限于環(huán)境因子，也就是說，土壤的生物物理過程支持著微生物生態(tài)位、生態(tài)功能的多樣性從而支持微生物的各種生命活動(dòng)[2-3]。土壤微生物多樣性包括結(jié)構(gòu)多樣性和功能多樣性兩方面，主要指微生物數(shù)量和種類的變異，土壤微生物群落的變化被視為衡量土壤環(huán)境健康的重要指標(biāo)。培養(yǎng)的方法觀察到的微生物不到微生物群落的1%，無法全面反映微生物的真實(shí)狀況。高通量測(cè)序的發(fā)展為微生物的生態(tài)和功能研究提供了各種便利[4]，能夠直觀地反映微生物群落組成，Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)具有高通量、價(jià)格低、運(yùn)行周期短等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，利用4種來源廣泛、廉價(jià)易得的有機(jī)覆蓋物覆蓋在播種三七種子土壤的表面，以不覆蓋為對(duì)照，研究有機(jī)覆蓋物對(duì)三七土壤養(yǎng)分以及三七土壤微生物生態(tài)和功能的影響，為有機(jī)覆蓋提高三七生產(chǎn)質(zhì)量提供理論和實(shí)踐上的支持，并為發(fā)展三七覆蓋種植及其配套栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于云南省武定縣大石頭房的云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所實(shí)驗(yàn)基地4 m高溫大棚內(nèi)，上方搭設(shè)聚乙烯白色薄膜和兩層黑色遮陰網(wǎng)，以避雨、遮蔭、防治鳥害，供試土壤為黏性紅壤，采用自來水噴灌，基地海拔1 910 m，屬低緯度高原季風(fēng)氣候。武定縣年平均氣溫15.1 ℃，1月平均氣溫7.2 ℃，6月平均氣溫20.9 ℃，極端最高氣溫34.5 ℃，極端最低氣溫-7.0 ℃。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018年1月之前整地、翻耕土壤，深度為30 cm左右。播種前10 d施入有機(jī)肥15 000 kg·hm-2，氮磷鉀復(fù)合肥150 kg·hm-2，鈣鎂磷肥1 500 kg·hm-2。整平耙細(xì)后作畦，畦寬1.2 m，畦高25 cm，畦周設(shè)有排水溝，畦距30 cm。采收足量覆蓋物黃花蒿(ArtemisiaannuaLinn., HHH)全株、萬壽菊(TageteserectaL.，WSJ)全株、金蕎麥[Fagopyrumdibotrys(D. Don) Hara，JQM]全株、云南松(PinusyunnanensisFranch. var.yunnanensis，SZ)松針，每種覆蓋物采收后洗凈干燥，打成3～5 cm小段備用。于2018年1月19日播種，種子先用多菌靈拌勻消毒，播種距離5 cm×5 cm，每穴播種一粒，播種后覆薄土。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將切小段的覆蓋物分別覆蓋在土壤表面，以不露土為準(zhǔn)，每種覆蓋處理重復(fù)3個(gè)小區(qū)，共5個(gè)處理，分別為黃花蒿(HHH)全株覆蓋、萬壽菊(WSJ)全株覆蓋、金蕎麥(JQM)全株覆蓋、云南松(SZ)松針覆蓋、無覆蓋物(CK)。小區(qū)面積1.5 m×1.2 m，共15個(gè)小區(qū)。每小區(qū)播種三七種子720粒，每處理播種2 160粒，后期養(yǎng)護(hù)管理方式一致。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1土壤養(yǎng)分的測(cè)定 土壤養(yǎng)分分析于2018年10月10日用五點(diǎn)等量混合取樣法取樣，取0—10 cm土層的土壤，風(fēng)干制樣，備用。土壤pH用雷磁PHSJ-5型酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器)[5]測(cè)定。有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀容量法檢測(cè)[6]。土壤全氮采用凱氏定氮法檢測(cè)[7]。土壤水解性氮用堿解擴(kuò)散法檢測(cè)[8]。有效磷用NaHCO3法測(cè)定，速效鉀用火焰光度法測(cè)定[9]。

1.3.2土壤微生物測(cè)序 土壤取樣：于2018年10月，取樣器具事先消毒滅菌，采樣時(shí)先去除表面覆蓋物和覆土，隨機(jī)挖取三七植株，抖落三七根上附著的土壤，去除可見雜質(zhì)，用2 mm篩網(wǎng)過篩處理，等量混合后每處理取3份土壤，分別放于10 mL凍存管里，共15份樣品，置于低溫環(huán)境運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存，用于DNA提取。

土壤基因組提?。翰捎?2888-50強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒(QIAGEN MOBIO)提取土壤基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和完整性。

測(cè)序：細(xì)菌鑒定區(qū)域?yàn)?6S rDNA基因的V3-V4區(qū)(前端引物: 343F-5′-TACGGRAGGCAG-CAG-3′；后端引物: 798R-5′-AGGGTATCTAA-TCCT-3′)，真菌對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行鑒定(前端引物: ITS1F-5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；后端引物: ITS2-5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司通過Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)完成。

1.3.3測(cè)序結(jié)果處理 利用QIIME軟件過濾含有N堿基的序列，去除單堿基重復(fù)大于8的序列，去除長(zhǎng)度小于200 bp的序列；使用UCHIME軟件去除嵌合體，得到最終用于分析的高質(zhì)量的優(yōu)化系列valid tags；利用軟件USEARCH在97%相似度下進(jìn)行聚類，并選取每個(gè)OTU中豐度最大的序列作為該OTU的代表序列，采用RDP classifier Naive Bayesian 分類算法對(duì)代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，注釋得到每個(gè)OTU的物種信息，根據(jù)每個(gè)OTU在各個(gè)樣本中包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU在各個(gè)樣本中的豐度矩陣文件。OTU分類匯總完成后對(duì)各個(gè)樣本中分類到該OTU的tags數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可以獲得各個(gè)OTU在每個(gè)樣本中的豐度情況。

1.4 數(shù)據(jù)整理與分析

利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析。用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理及圖表制作，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)物覆蓋對(duì)土壤pH和土壤養(yǎng)分的影響

2.1.1土壤pH和養(yǎng)分變化 覆蓋10個(gè)月后的土壤養(yǎng)分檢測(cè)結(jié)果見表1，可知，處理HHH和WSJ的土壤pH顯著低于CK。HHH和SZ處理的有機(jī)質(zhì)含量顯著高于CK，處理WSJ和JQM顯著低于CK。HHH處理的全氮含量顯著高于CK，其他處理全氮顯著低于CK。HHH處理的水解性氮含量顯著高于CK。SZ處理的有效磷含量顯著高于CK，其他處理低于CK。SZ處理的土壤速效鉀含量顯著高于CK，HHH和WSJ處理顯著低于CK。因此，黃花蒿和松針覆蓋有利于提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，松針覆蓋有利于土壤有效磷和速效鉀含量的提高。

表1 不同覆蓋處理對(duì)土壤pH和土壤養(yǎng)分的影響Table 1 Effects of different mulching treatments on soil pH and soil nutrients

2.1.2土壤養(yǎng)分指標(biāo)的相關(guān)性分析 對(duì)土壤養(yǎng)分指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，絕對(duì)值越大表示相關(guān)性越強(qiáng)。由表2可知，pH與有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)，與全氮和水解性氮呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，與有效磷呈較強(qiáng)正相關(guān)，與速效鉀呈強(qiáng)正相關(guān)。有機(jī)質(zhì)與全氮、水解性氮、有效磷、速效鉀之間均呈正相關(guān)，全氮與水解性氮呈極強(qiáng)正相關(guān)且相關(guān)性顯著。說明有機(jī)質(zhì)的增加有利于土壤pH的升高，有機(jī)質(zhì)的增加有利于全氮、水解性氮、有效磷、速效鉀的提高。

表2 土壤養(yǎng)分指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 2 Pearson correlation of soil nutrient indexes

2.2 土壤細(xì)菌高通量測(cè)序

2.2.1細(xì)菌測(cè)序結(jié)果 土壤細(xì)菌的測(cè)序結(jié)果見表3，可知valid tags數(shù)在各處理之間無顯著差異，不同處理的序列長(zhǎng)度大小表現(xiàn)為：JQM>SZ>WSJ>CK>HHH。valid tags平均長(zhǎng)度分布在427.05～430.73 bp，15個(gè)土壤樣本共獲得總OTU數(shù)目4 281個(gè)，共有OTU數(shù)目789個(gè)，各處理OTU數(shù)量由多到少表現(xiàn)為：JQM>WSJ>SZ>CK>HHH，其中，JQM、SZ、WSJ處理之間OTU數(shù)目無顯著差異，均顯著高于CK，HHH處理OTU個(gè)數(shù)顯著低于對(duì)照。

表3 不同覆蓋物土壤的細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of bacterial sequencing data of soils with different mulching treatments

將土壤樣本測(cè)序所得的OUT結(jié)果進(jìn)行Taxon統(tǒng)計(jì)，可知，門(Phylum)水平下共27個(gè)物種，綱(Class)水平共64個(gè)物種，目(Order)水平有131個(gè)物種，科(Family)水平上263個(gè)物種，屬(Genus)水平有444個(gè)物種，OTU水平共計(jì)4 281個(gè)物種。

2.2.2細(xì)菌多樣性分析 Chao1指數(shù)表示估計(jì)群落中實(shí)際存在的OTU個(gè)數(shù)。Coverage數(shù)值反映測(cè)序深度，數(shù)值越接近1，說明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。Shannon指數(shù)越大，表明樣品群落多樣性越高。Simpson指數(shù)對(duì)普遍物種所起的作用大，對(duì)稀有物種起的作用小，Simpson指數(shù)越大，表明群落多樣性越好，個(gè)體分配越均勻。由表4可知，不同處理的Chao1指數(shù)由高到低表現(xiàn)為：JQM>WSJ>SZ>CK>HHH，JQM、SZ、WSJ處理的Chao1指數(shù)顯著高于CK，HHH的Chao1指數(shù)顯著低于CK。各處理物種覆蓋率均大于0.97，說明本次測(cè)序深度能夠較好地反映樣本中細(xì)菌的真實(shí)情況。土壤樣品Shannon指數(shù)排序?yàn)椋篧SJ>JQM>SZ>CK>HHH，JQM、SZ、WSJ處理之間Shannon指數(shù)無顯著差異，均顯著高于CK，HHH處理Shannon指數(shù)顯著低于CK。Simpson指數(shù)排序由高到低為：CK>WSJ>JQM>SZ>HHH，各處理之間無顯著差異。松針和金蕎麥真菌群落豐富度高于對(duì)照，松針真菌豐富度高，可能是因?yàn)樗舍樦泻卸喾N碳源和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為真菌提供更加適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，易于真菌生物量的增加。

表4 不同覆蓋處理土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 4 Diversity index of bacteria in different mulching treatments

2.2.3土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)boxplot圖 由土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)的boxplot圖(圖1)可以看出，5個(gè)處理間細(xì)菌多樣性差異顯著(P=0.024)，JQM的箱體最高，所以JQM的3個(gè)土壤樣本的微生物多樣性離散程度大。HHH處理的3個(gè)土壤樣本的細(xì)菌多樣性較為一致，但多樣性指數(shù)比無覆蓋處理小，即HHH的細(xì)菌多樣性較對(duì)照低。

2.2.4土壤細(xì)菌主成分分析 通過主成分分析(principal component analysis，PCA)，依據(jù)不同覆蓋處理的細(xì)菌菌群的異同，對(duì)不同覆蓋處理進(jìn)行聚類，分析其異同，觀察不同樣本點(diǎn)間的距離大小判斷它們的菌群相似性，兩點(diǎn)距離越近，說明二者菌群組成結(jié)構(gòu)越相似。由圖2可以看出，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)是造成15個(gè)樣品的兩個(gè)最大差異特征，貢獻(xiàn)率分別為23.88%和16.79%，不同覆蓋物處理之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，但組內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較小。

2.2.5土壤細(xì)菌在門水平下相對(duì)豐度前10名統(tǒng)計(jì) 所有樣品在門水平上共27個(gè)門類別，其中主要細(xì)菌門有：變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)等(圖3)。其中，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門是占主導(dǎo)地位的細(xì)菌門，所占比例總和達(dá)80%以上，是土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門。處理SZ和JQM中，變形菌門和擬桿菌門豐度比其他處理大，HHH的放線菌門豐度顯著高于無覆蓋處理。芽單胞菌門在JQM、WSJ處理中相對(duì)豐度高，HHH和SZ中較低。酸桿菌門在所有覆蓋處理中相對(duì)豐度高于對(duì)照。

2.2.6土壤細(xì)菌在屬水平下相對(duì)豐度前10名統(tǒng)計(jì) 在屬水平上，15份土壤樣品共鑒定出444個(gè)物種，Acidibacter、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、Nocardioides、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Kribbella、德沃斯氏菌屬(Devosia)、Rhizomicrobium、糞腸球菌屬(Ohtaekwangia)、Rhodanobacter是主要的細(xì)菌(圖4)。本研究發(fā)現(xiàn)，芽單胞菌屬在覆蓋處理中低于對(duì)照，黃桿菌屬細(xì)菌的豐度在覆蓋處理土壤中顯著高于對(duì)照。HHH處理的Rhizomicrobium豐度顯著高于CK和其它處理。Nocardioides細(xì)菌豐度在覆蓋處理中均顯著低于CK。各處理間鞘氨醇單胞菌屬差異不大，CK和HHH處理的Rhodanobacter相對(duì)豐度高于JQM、SZ、WSJ處理。說明覆蓋有利于黃桿菌屬的生長(zhǎng)，不利于芽單胞菌屬細(xì)菌的生長(zhǎng)，黃花蒿覆蓋有利于Rhizomicrobium和Rhodanobacter的生長(zhǎng)。

2.2.7屬水平前10名細(xì)菌與養(yǎng)分相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果(表5)表明，Acidibacter屬與土壤pH和有效磷含量呈高相關(guān)性且相關(guān)性顯著，說明pH升高和有效磷含量升高有利于Acidibacter的生長(zhǎng)。芽單胞菌屬與所有土壤養(yǎng)分指標(biāo)都呈負(fù)相關(guān)，說明芽單胞菌屬和黃桿菌屬屬于貧營(yíng)養(yǎng)菌群，養(yǎng)分較為豐富的土壤反而不適宜其生長(zhǎng)。Kribbella和Rhodanobacter與pH呈高負(fù)相關(guān)且相關(guān)性顯著，說明酸性土壤有利于這兩個(gè)屬細(xì)菌的生長(zhǎng)。水解性氮與Nocardioides、Ohtaekwangia、Rhodanobacter相關(guān)性均顯著。

表5 土壤理化性質(zhì)與屬水平前10名細(xì)菌相對(duì)豐度的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between soil physical and chemical properties and relative abundance of the top 10 bacteria at genus level

2.3 土壤真菌高通量測(cè)序

2.3.1土壤真菌測(cè)序結(jié)果分析 土壤真菌的測(cè)序結(jié)果見表6，可見，valid tags平均長(zhǎng)度在264.4～285.4 bp之間，覆蓋處理的平均序列長(zhǎng)度顯著高于對(duì)照。SZ處理OTU 數(shù)目顯著高于JQM、WSJ、CK處理，HHH處理OTU數(shù)目顯著低于其他處理。15個(gè)土壤樣本獲得總OTU數(shù)2 894個(gè)，共有OTU數(shù)為188個(gè)，OTU數(shù)量由多到少表現(xiàn)為: SZ>JQM>CK>WSJ>HHH。將所有測(cè)序所得的OTU表進(jìn)行Taxon個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在門水平下共12個(gè)物種，綱水平共40個(gè)物種，目水平上有115個(gè)物種，科水平上246個(gè)物種，屬水平有510個(gè)物種。

表6 不同覆蓋處理土壤樣品的真菌測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 6 Fungi sequencing data statistics of soil samples with different mulching treatments

2.3.2真菌多樣性指數(shù) 不同處理的真菌多樣性分析結(jié)果見表7，由Chao1指數(shù)可以看出，真菌群落豐富度由高到低排列為：SZ>CK>JQM>WSJ>HHH，SZ處理Chao1指數(shù)顯著高于其他處理，其余處理Chao1指數(shù)之間無顯著性差異。樣品中物種覆蓋率均大于0.99，說明本次測(cè)序深度能夠較完整地反映樣本中真菌群落的真實(shí)情況。Shannon指數(shù)由高到低排列為：CK>SZ>JQM>WSJ>HHH，HHH覆蓋處理Shannon指數(shù)顯著低于CK、SZ、JQM處理。Simpson指數(shù)由大到小排列為：CK>SZ>JQM>WSJ>HHH，各覆蓋處理之間Simpson指數(shù)無顯著性差異。

表7 不同覆蓋土壤真菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 7 Fungi diversity index statistics of different mulching treatments

2.3.3不同覆蓋處理的土壤真菌NMDS分析

由圖5可以看出，處理JQM和CK距離較近，說明JQM和CK處理的真菌群落結(jié)構(gòu)相似，差異不大，而SZ、WSJ、HHH處理的NMDS距離較遠(yuǎn)，說明這幾個(gè)處理間真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

2.3.4不同覆蓋物土壤真菌在門水平上的相對(duì)豐度由圖6可知，在門水平上，子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)為優(yōu)勢(shì)菌門，子囊菌門最高，是真菌當(dāng)中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，子囊菌門的相對(duì)豐度由高到低的處理為：CK>SZ>HHH>JQM>WSJ。擔(dān)子菌門各處理的豐度由高到低為：HHH>JQM>WSJ>SZ>CK。接合菌門在HHH處理中豐富度最低。說明HHH覆蓋土壤不利于接合菌門真菌的生長(zhǎng)。

2.3.5不同覆蓋物土壤真菌在屬水平上前10名的相對(duì)豐度 不同覆蓋物土壤真菌在屬水平上的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖7)可知，在屬水平上，錐蓋傘屬(Conocybe)、鐮刀菌屬(Fusarium)、被孢霉屬(Mortierella)、Trichispora、口蘑屬(Clitopilus)、木霉屬 (Trichoderma)、支頂孢屬(Acremonium)、MonograpHella、毛殼屬(Chaetomium)、炭角菌屬(Xylaria)是優(yōu)勢(shì)菌屬，錐蓋傘屬相對(duì)豐度由高到低表現(xiàn)為：JQM>SZ>CK>WSJ>HHH。被孢霉屬在HHH中豐度最小。鐮刀霉屬在CK中相對(duì)豐度最大，覆蓋處理比CK小。Trichispora是HHH處理相對(duì)豐度最大的菌屬，在SZ和WSJ處理中僅存在較少數(shù)，而在其他覆蓋處理中相對(duì)豐度幾乎為零?？谀僭赪SJ處理中相對(duì)豐度大，CK中幾乎為零。木霉屬在CK中豐度最低。Monographella在CK中豐度最大，炭角菌屬在WSJ處理中相對(duì)豐度最高，其余處理無顯著性差異。

2.3.6真菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的關(guān)系

由表8可知，錐蓋傘屬和被孢霉屬與pH之間呈強(qiáng)正相關(guān)，粗糙孔菌屬(Trechispora)、木霉屬、支頂孢屬(Acremonium)與pH呈負(fù)相關(guān)。Conocybe、Mortierella與全氮之間呈極強(qiáng)負(fù)相關(guān)。Trechispora、支頂孢屬與有效磷呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)。Clitopilus、Trichoderma、Xylaria與速效鉀呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)。水解性氮與被孢霉屬相關(guān)性顯著，速效鉀分別與Clitopilus、Trichoderma、Xylaria相關(guān)性顯著。全氮與粗糙孔菌屬的相關(guān)性顯著。

表8 土壤養(yǎng)分性質(zhì)與屬水平前10名真菌豐度的相關(guān)性分析Table 8 Correlation analysis between soil physical and chemical properties and relative abundance of the top 10 fungi at genus level

3 討論

3.1 不同覆蓋物對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐富度的影響

本研究5個(gè)處理的土壤中，細(xì)菌數(shù)量多、分布廣，在土壤微生物類群中起主導(dǎo)作用。曾路生等[10]研究也發(fā)現(xiàn)在土壤微生物中細(xì)菌的多樣性是最高的。金蕎麥、松針、萬壽菊覆蓋的細(xì)菌OTU數(shù)量高于無覆蓋處理，這可能是由于覆蓋物的加入為土壤帶來大量易利用有機(jī)質(zhì)，促進(jìn)土壤中豐富營(yíng)養(yǎng)型微生物生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致OTU豐度升高。本研究中，金蕎麥、萬壽菊、松針處理的豐富度比對(duì)照高，黃花蒿豐度小于對(duì)照。Shannon多樣性排序?yàn)椋喝f壽菊>金蕎麥>松針>無覆蓋>黃花蒿，Simpson多樣性排序?yàn)椋簾o覆蓋>萬壽菊>金蕎麥>松針>黃花蒿，出現(xiàn)差異的原因一方面是測(cè)序覆蓋率的差別，另一方面是Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)計(jì)算方法的差異。但都能看出黃花蒿處理的菌群多樣性較低，說明黃花蒿抑制微生物生長(zhǎng)繁殖。這與李倩等[11]研究發(fā)現(xiàn)黃花蒿覆蓋物降低土壤微生物多樣性和均勻度指數(shù)結(jié)果一致。

變形菌門和放線菌門在土壤中普遍存在[12-13]，變形菌門是土壤中的優(yōu)勢(shì)代表，能進(jìn)行厭氧光合作用。放線菌門是第二優(yōu)勢(shì)菌門，不僅在自然界物質(zhì)循環(huán)中起到重要作用，還能促使土壤形成團(tuán)粒結(jié)構(gòu)而改善土壤，本研究中變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。變形菌門、擬桿菌門、硝化螺旋菌門細(xì)菌主要參與碳氮循環(huán)，植物利用的氮元素和碳元素都需經(jīng)過生物固氮和CO2固定途徑進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)。自然環(huán)境(pH、水分、光照、溫度)和人類活動(dòng)(農(nóng)藥、化肥的使用和耕作方法)都會(huì)對(duì)土壤微生物的多樣性產(chǎn)生影響[13]。酸桿菌門作為一種嗜酸菌，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色。本研究中黃花蒿、萬壽菊、金蕎麥、松針處理的酸桿菌門豐度較對(duì)照高，說明覆蓋后有利于酸桿菌門細(xì)菌的生長(zhǎng)。柳春林等[14]研究認(rèn)為，酸性的土壤環(huán)境有利于酸桿菌門的生長(zhǎng)，這與本研究中萬壽菊和黃花蒿土壤pH低，酸桿菌門豐度高結(jié)果一致。擬桿菌門與土壤碳的有效性呈顯著正相關(guān)，松針處理有機(jī)質(zhì)含量相對(duì)較高，擬桿菌門豐度大。

芽單胞菌屬是一類常見的根際促生細(xì)菌，對(duì)植物誘導(dǎo)抗性系統(tǒng)、促進(jìn)生長(zhǎng)、減少病害發(fā)生有積極作用[15]，本研究中覆蓋處理的芽單胞菌屬豐富度低于對(duì)照，覆蓋對(duì)芽孢桿菌屬產(chǎn)生了抑制作用。有研究表明土壤酸化不利于黃桿菌屬細(xì)菌的生存[16]，這與本研究中黃桿菌屬豐度與pH存在正相關(guān)關(guān)系，覆蓋處理豐度高于對(duì)照的結(jié)果一致。擬桿菌門中鞘脂單胞菌屬既可抵抗植物病害、降解纖維素，又能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，鞘脂單胞菌屬在pH為中性時(shí)活性最好[17-18]。本研究中土壤pH差異不大，所以鞘氨醇單胞菌屬豐度相差不大。

3.2 不同覆蓋物對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

本研究真菌測(cè)序覆蓋率大于0.99，能夠完整地反映樣本中真菌群落的真實(shí)情況，OTU數(shù)量和Chao1指數(shù)都可以看出，不同處理真菌豐富度由多到少順序?yàn)椋核舍?金蕎麥>無覆蓋>萬壽菊>黃花蒿，由Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)看出，真菌多樣性由高到低排列為：無覆蓋>松針>金蕎麥>萬壽菊>黃花蒿。松針和金蕎麥處理真菌群落豐富度高于對(duì)照，松針處理真菌豐富度高，可能是因?yàn)樗舍樦泻卸喾N碳源和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為真菌提供更加適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，易于真菌生物量的增加。

覆蓋處理土壤的真菌群落多樣性都低于無覆蓋處理土壤，說明覆蓋對(duì)土壤真菌的多樣性以及群落結(jié)構(gòu)多樣性都產(chǎn)生了不利影響?？赡苁撬舍槨⒔鹗w麥、萬壽菊、黃花蒿中的某些成分通過淋溶作用釋放到土壤中，降低了微生物活性，抑制真菌的生長(zhǎng)，從而降低了真菌多樣性[19-20]。曾維才等[19]研究表明松針不同溶劑提取物具有抑菌效果，黃仁術(shù)等[21]和馮黎莎等[22]研究結(jié)果表明金蕎麥含有的苷類、黃酮類、甾體類、萜類、有機(jī)酸類等化合物具有抑菌活性，萬壽菊提取液對(duì)青霉、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有抑菌作用[23-24]，李倩等[11]和武月紅[25]研究表明黃花蒿提取物對(duì)尖孢鐮刀菌具有抑制作用。這些結(jié)果均與本研究結(jié)果一致。闞麗艷[26]研究表明，松針覆蓋后土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量及多樣性都升高，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是因?yàn)椴煌N植土壤及環(huán)境因子差異所致。

被孢霉屬真菌通過生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)作用抑制有害病菌的的生長(zhǎng)[27]，是三七土壤中的有益菌和優(yōu)勢(shì)菌。大量研究證明，鐮刀菌屬真菌是造成三七、黃芪、白術(shù)、川芎、人參、麻黃等藥用植物根腐病的主要病原菌，寄生性和致病力較強(qiáng)，初期由侵染性較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)病原菌進(jìn)行侵染，造成植株根部的局部損傷或在與寄主寄生過程中干擾了寄主細(xì)胞的正常代謝，降低寄主抗病能力，或者產(chǎn)生了誘導(dǎo)病原菌侵入的化學(xué)分泌物，導(dǎo)致染病植株生物量失衡與代謝失控，為較弱侵染力的病原菌創(chuàng)造了有利條件和途徑，待后續(xù)病菌侵入后快速大量繁殖或產(chǎn)生毒素，加快根部腐爛進(jìn)程，最終造成植株的死亡[28-32]。鐮刀菌引起的病害屬于土傳病害，根腐病是嚴(yán)重限制三七產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，嚴(yán)重的可致三七毀園絕收。本研究中覆蓋物處理后土壤鐮刀菌屬的相對(duì)豐度比對(duì)照小，說明覆蓋物抑制了鐮刀菌屬的生長(zhǎng)與繁殖，有減少三七根腐病害的作用，因此三七種植生產(chǎn)中可以考慮利用松針、黃花蒿、金蕎麥、萬壽菊來進(jìn)行三七的生物防治和綠色種植，減少三七栽培過程中對(duì)農(nóng)藥的依賴。

木霉菌是廣泛分布于土壤中的習(xí)居菌，通過多種作用機(jī)制對(duì)病原菌產(chǎn)生拮抗作用[33]。木霉能產(chǎn)生代謝物促進(jìn)植物生長(zhǎng)，促進(jìn)土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放等，提高植物抗逆能力[34]，本研究中木霉屬在對(duì)照中水平較低，在有機(jī)覆蓋中豐度高，說明覆蓋有利于木霉菌的生長(zhǎng)，為三七生長(zhǎng)提供有利條件，提高三七的抗病原菌能力。

付麗娜等[35-36]研究表明，感病三七較健康三七根際土壤中有益微生物(木霉和放線菌等)的種類和數(shù)目更少，而病原微生物(鐮刀菌、黃桿菌等)的種類和數(shù)目較多，病感三七根際土壤微生物多樣性減弱，結(jié)構(gòu)組成均變得簡(jiǎn)單化。崔尹贍[37]研究表明,三七得病后活躍細(xì)菌群落的多樣性增加，認(rèn)為藍(lán)藻門、擬桿菌門、放線菌門和酸桿菌門可以作為生病和健康三七的指示菌。譚勇等[38]發(fā)現(xiàn),種植過三七的土壤微生物數(shù)量降低、細(xì)菌數(shù)量減少、真菌數(shù)量增加，微生物多樣性下降。苗翠萍[27]卻發(fā)現(xiàn),病根的細(xì)菌數(shù)目顯著大于健株，放線菌和真菌的數(shù)目小于健株。本研究中，生長(zhǎng)情況良好的松針覆蓋的有益微生物(放線菌、木霉屬)豐度高，三七致病菌(鐮刀菌)豐度低，這可能提示松針覆蓋對(duì)減輕三七根腐病的發(fā)生和解決三七種植過程中的連作障礙有一定作用。

3.3 有機(jī)物覆蓋后土壤pH、養(yǎng)分狀況與土壤微生物的相關(guān)性分析

覆蓋物分解主要在土壤表面進(jìn)行，因此土壤理化性質(zhì)對(duì)覆蓋物的分解有較大的影響。覆蓋物的分解過程是由土壤微生物和相關(guān)酶來實(shí)現(xiàn)的，溫度升高有利于微生物生長(zhǎng)和酶活性提高[39]，因此覆蓋物的分解效率與土壤溫度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌和真菌群落存在強(qiáng)相關(guān)性，土壤因子(溫度、水分、ph、養(yǎng)分等)通過影響土壤微生物的活動(dòng)空間和土壤酶的活性間接影響覆蓋物分解過程和分解速率，在分解過程中覆蓋物的成分與化學(xué)性質(zhì)不斷變化，對(duì)覆蓋物下一階段的分解和微生物活動(dòng)產(chǎn)生動(dòng)態(tài)影響。不同土壤pH會(huì)造成微生物數(shù)量和多樣性的改變[40]，與本研究中pH與微生物群落結(jié)構(gòu)存在較強(qiáng)相關(guān)性的結(jié)果一致。國(guó)春菲[41]和張媚等[42]研究表明,土壤低pH有利于提高真菌多樣性。三七適宜生長(zhǎng)的環(huán)境為偏酸性土壤，酸性環(huán)境有利于增強(qiáng)真菌對(duì)環(huán)境中水分的利用，以加快自身生長(zhǎng)繁殖，還會(huì)加重植物病害。pH、速效磷、速效氮為土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬群落結(jié)構(gòu)的顯著性影響因子，而pH、速效鉀、速效氮為土壤真菌優(yōu)勢(shì)屬群落結(jié)構(gòu)的顯著性影響因子。