賈明良, 方荷芳, 李同建, 文鋒, 韓興杰, 金洪光,徐玲玲, 廖亮

(九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 江西 九江 332000)

百合為百合科百合屬的多年生觀賞植物，其品種豐富，花色多樣，具有非常高的觀賞價(jià)值。東方百合‘索邦’為百合切花市場(chǎng)的知名品種。我國(guó)市場(chǎng)的百合鮮切花種源主要有進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)兩個(gè)來(lái)源，但國(guó)產(chǎn)種球的切花品質(zhì)要低于進(jìn)口種球，究其原因，種球質(zhì)量是其中的重要因素[1]。雖有研究表明，可以通過(guò)高山繁育技術(shù)來(lái)解決種球品質(zhì)退化的問(wèn)題[2]，但由于傳統(tǒng)的百合生產(chǎn)無(wú)論是自然繁殖還是鱗莖片扦插繁殖[3]，在繁殖過(guò)程中都會(huì)由于病毒的侵染和積累導(dǎo)致種球品質(zhì)下降。如何大量得到種球的同時(shí)提高種球品質(zhì)，是提高國(guó)產(chǎn)種球質(zhì)量，滿(mǎn)足市場(chǎng)需求的必經(jīng)之路。

針對(duì)病毒的侵染，已有學(xué)者進(jìn)行了莖尖和超低溫脫毒研究[4]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)東方百合‘索邦’研究獲得優(yōu)質(zhì)種苗，也有一些報(bào)導(dǎo)[5-6]，所用到的外植體類(lèi)型有鱗莖[7-8]、花器官[9-10]、葉片[11-12]等，也有學(xué)者進(jìn)行了射線(xiàn)輻射[13]和轉(zhuǎn)基因[14]等研究。由于東方百合‘索邦’的市場(chǎng)需求量較大，其離體培養(yǎng)技術(shù)還有待進(jìn)一步完善，以期為規(guī)?；N苗的生產(chǎn)提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。本研究利用市售的東方百合‘索邦’鮮切花為材料，取其花器官為外植體，培養(yǎng)得到無(wú)菌苗，而后比較組培苗不同部位的愈傷組織誘導(dǎo)率，進(jìn)一步進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽增殖和生根培養(yǎng)等方面研究，為完善東方百合‘索邦’的離體培養(yǎng)體系，進(jìn)行優(yōu)質(zhì)種球的規(guī)模化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料東方百合‘索邦’鮮切花購(gòu)自花店，以含苞待放的花朵為佳，購(gòu)買(mǎi)后將材料置于采樣袋內(nèi)，噴水保濕后帶回試驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1初始誘導(dǎo)外植體的選取 以子房、花梗及花瓣作為外植體，流水沖洗后，75%酒精消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3次，然后升汞滅菌5 min，無(wú)菌水沖洗6次。將子房、花梗和花瓣切成小塊，大小0.5 cm左右，接種到 MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx、光照時(shí)間12 h·d-1、溫度(25±1)℃。25 d后統(tǒng)計(jì)污染率、存活率及愈傷誘導(dǎo)率。

1.2.2愈傷誘導(dǎo)外植體比較 將初始誘導(dǎo)的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)成苗，培養(yǎng)60 d后，小苗株高為3～5 cm時(shí)，取葉片和鱗莖片，將材料分為葉片上部、葉片中部、葉片下部和鱗莖片 4個(gè)部分后，接種于 MS+1.0 mg·L-12,4-D +0.5 mg·L-16-BA +30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2.1。培養(yǎng)45 d后觀察統(tǒng)計(jì)不同外植體類(lèi)型的愈傷誘導(dǎo)率、死亡率、叢生芽誘導(dǎo)率等。

1.2.3愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 以1.2.2試驗(yàn)中得到的愈傷誘導(dǎo)較好的葉片下部和鱗莖片為外植體，設(shè)置5種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別為MS+0.2 mg·L-12,4-D(YS1)、MS+ 2.0 mg·L-12,4-D(YS2)、MS+ 0.2 mg·L-16-BA(YS3)、MS+2.0 mg·L-16-BA (YS4)、MS+2.0 mg·L-12,4-D +0.2 mg·L-16-BA (YS5)。接種后培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.2.1。培養(yǎng)45 d后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率、叢生芽誘導(dǎo)率、生根率等。

1.2.4叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選試驗(yàn) 為方便統(tǒng)計(jì)叢生芽誘導(dǎo)的增殖倍數(shù)，將誘導(dǎo)得到的不定芽切去葉片，進(jìn)一步再切成黃豆大小接種到添加不同濃度6-BA、NAA配比的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，包括MS+l.0 mg·L-16-BA +0.l mg·L-1NAA(CSY1)、MS+l.0 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1NAA(CSY2)、MS+2.0 mg·L-16-BA +0.l mg·L-1NAA(CSY3)、MS+2.0 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1NAA(CSY4)、MS+5.0 mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1NAA(CSY5)。培養(yǎng)條件同1.2.1。培養(yǎng)45 d后觀察統(tǒng)計(jì)分化率、增殖倍數(shù)、叢生芽生長(zhǎng)情況等。

1.2.5生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選試驗(yàn) 將生長(zhǎng)一致且健壯的無(wú)菌苗單株切下，如有長(zhǎng)根切去根，接種到含有不同濃度NAA的MS培養(yǎng)基中，NAA設(shè)定濃度為0.1 mg·L-1(SG1)、0.2 mg·L-1(SG2)、0.5 mg·L-1(SG3)、2.0 mg·L-1(SG4)及5.0 mg·L-1(SG5)。每天觀察直至出根，記錄出根天數(shù)。培養(yǎng)條件同1.2.1。培養(yǎng)45 d后觀察統(tǒng)計(jì)生根率、出根天數(shù)、根數(shù)、根長(zhǎng)、生根苗狀態(tài)等。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始誘導(dǎo)外植體選擇

不同花器官部位的愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)，相同滅菌條件下，子房外植體的污染率為5.33%，顯著低于花梗和花瓣。存活率方面，子房外植體最高，花梗次之，花瓣最低，不同部位之間差異顯著。究其原因可能是花梗，尤其是花瓣暴露在外，污染率較高，加上褐化的產(chǎn)生，導(dǎo)致存活率較低。從愈傷誘導(dǎo)率方面看，子房外植體最高，為84.33%，顯著高于花梗和花瓣，花瓣的愈傷誘導(dǎo)率最低，僅為5%，可能跟花器官的發(fā)育程度以及幼嫩程度有關(guān)。因此綜合考慮，初始誘導(dǎo)建立無(wú)菌體系應(yīng)選擇子房作為外植體。

表1 不同花部位初始誘導(dǎo)效果比較Table 1 Comparison of initial induction effect of different parts of flower (%)

2.2 愈傷誘導(dǎo)外植體比較

對(duì)無(wú)菌苗的不同部位進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，結(jié)果(表2)可見(jiàn)，各部分的愈傷誘導(dǎo)率最高的是葉片下部，為100%；其次是鱗莖片，為93.1%；葉片上部最低，愈傷誘導(dǎo)率僅為6.57%。葉片上部雖有分化能力，但愈傷誘導(dǎo)率極低，死亡率最高，達(dá)54.43%；葉片中部愈傷誘導(dǎo)的死亡率也較高，為13.43%；而葉片下部和鱗莖片的死亡率均為0。由于百合愈傷生長(zhǎng)和叢生芽生長(zhǎng)并無(wú)明顯界限，因此也統(tǒng)計(jì)了叢生芽誘導(dǎo)的情況。不同部位均可誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，以葉片下部為外植體的叢生芽誘導(dǎo)率最高，為93.10%，顯著高于其他3種外植體；其次為鱗莖片，叢生芽誘導(dǎo)率為79.67%。

表2 不同外植體的愈傷誘導(dǎo)能力Table 2 Callus induction ability of different explants (%)

無(wú)菌苗不同部位誘導(dǎo)的生長(zhǎng)情況(圖1)顯示，葉片下部和鱗莖片得到的愈傷組織及叢生芽呈現(xiàn)黃綠色，生長(zhǎng)健壯，而葉片上部和葉片中部誘導(dǎo)的愈傷組織部分發(fā)生褐化、死亡，且愈傷組織及叢生芽長(zhǎng)勢(shì)較弱。綜合愈傷誘導(dǎo)統(tǒng)計(jì)情況及誘導(dǎo)材料生長(zhǎng)狀況，進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)時(shí)適宜選用葉片下部或鱗莖片作為外植體。

2.3 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

不同愈傷培養(yǎng)基的外植體生長(zhǎng)情況(表3)可知，培養(yǎng)基YS2和YS5的葉片下部愈傷誘導(dǎo)率顯著高于其他3個(gè)培養(yǎng)基處理；培養(yǎng)基YS2鱗莖片的愈傷誘導(dǎo)率最高，顯著高于其他4個(gè)培養(yǎng)基處理，其次為YS5。培養(yǎng)基YS2葉片下部的叢生芽誘導(dǎo)率最高，為99.33%，顯著高于其他4個(gè)培養(yǎng)基處理，其次為YS5；而培養(yǎng)基YS4和YS5的鱗莖片的叢生芽誘導(dǎo)率顯著高于其他3個(gè)培養(yǎng)基處理，叢生芽誘導(dǎo)率分別為80.00%和79.00%。綜合愈傷誘導(dǎo)率和叢生芽誘導(dǎo)率，葉片下部和鱗莖片的合適愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為YS2和YS5。此外，在誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，YS1和YS2培養(yǎng)基中，產(chǎn)生叢生芽的同時(shí)還會(huì)生根，葉片下部的生根率分別為86.23%和93.43%，鱗莖片的生根率分別為93.43%和100%，而根的存在會(huì)影響后續(xù)的切割接種。因此，YS5為最合適的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，即MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8。

表3 外植體在不同激素組合培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況Table 3 Growth of explants in medium with different hormone combinations (%)

2.4 叢生芽增殖培養(yǎng)基篩選結(jié)果

不同培養(yǎng)基的叢生芽增殖情況見(jiàn)表4，可見(jiàn)，不同培養(yǎng)基的分化率均為100%，但增殖倍數(shù)有所差異，CSY5的增值倍數(shù)最高，為3.96倍，其次為CSY3(3.44)和CSY1(3.26)，三者間差異顯著，增殖倍數(shù)最低的為CSY4和CSY2，分別為 3.18和3.14倍，兩者無(wú)顯著差異。從叢生芽生長(zhǎng)情況看，CSY5處理雖然能誘導(dǎo)得到較多的叢生芽，但芽的葉片卷曲且有部分玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生。而CSY3處理的叢生芽較為瘦弱，并有一半生根。CSY4除增值倍數(shù)較低外，芽較小，葉片出現(xiàn)卷曲玻璃化現(xiàn)象。CSY2的芽弱小、有一半已生根，且增殖倍數(shù)較低。綜合考慮，選擇CSY1(MS+l.0 mg·L-16-BA +0.l mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖 +6.5 g·L-1瓊脂)作為最佳叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，得到的增殖倍數(shù)雖不是最高，但其得到的叢生芽比較整齊，葉片寬大，且無(wú)根，利于后續(xù)增殖切割或進(jìn)一步進(jìn)行生根培養(yǎng)操作。

表4 不同激素配比對(duì)叢生芽增殖的影響Table 4 Effects of different hormone combinations on proliferation of cluster buds

2.5 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選結(jié)果

對(duì)不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)表5，可見(jiàn)，不同NAA激素水平下，生根率均為100%，出根天數(shù)也無(wú)差別，均為7 d。根長(zhǎng)度方面雖有差別，但無(wú)顯著差異。從根數(shù)量來(lái)看，最多的為SG5培養(yǎng)基，根數(shù)量達(dá)13.77；其次為SG3，根數(shù)量為12.53；SG4、SG2和SG1的根數(shù)量分別為11.57、10.37和8.5，不同培養(yǎng)基之間均存在顯著差異。從根和植株生長(zhǎng)狀態(tài)(表5，圖2)來(lái)看，生根數(shù)量最多的SG5培養(yǎng)基，苗的根粗長(zhǎng)，有大量根毛，會(huì)粘附培養(yǎng)基，不利于清洗移栽，且植株葉片稀疏(圖2F)。而SG3的根數(shù)量雖不是最多，但較粗壯，且植株葉片較多，利于后續(xù)移栽(圖2D)。SG4不僅根數(shù)較SG5和SG3少，且根短粗，葉細(xì)長(zhǎng)稀疏。而SG2和SG1不僅根數(shù)少，且根細(xì)長(zhǎng)，根毛少。因此，選擇SG3(MS+0.5 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖 +6.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8)作為生根培養(yǎng)基。

表5 不同激素配比對(duì)生根的影響Table 5 Effects of different hormone combinations on rooting

3 討論

目前，對(duì)于東方百合‘索邦’的組織培養(yǎng)，多數(shù)采用鱗莖片作為外植體[7-8]，鱗莖片作為外植體具有誘導(dǎo)效率高的特點(diǎn)，但由于其生長(zhǎng)于地下，因此滅菌有一定難度。也有利用株芽、莖段和葉片等為外植體的報(bào)導(dǎo)[15-16]?；ㄆ鞴僮鳛橥庵搀w具有品種特征突出，取材方便，滅菌容易等特點(diǎn)，主要取材部位為花瓣、花絲、花托和花梗[9-10]。本研究預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)花絲作為外植體發(fā)生全部褐化。因此，主要選用花梗、子房和花瓣為外植體。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)選擇子房作為初始誘導(dǎo)的外植體，與潘娟[17]的研究結(jié)果一致。

將初始誘導(dǎo)得到的叢生芽進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)增殖時(shí)需要進(jìn)行材料的選擇，本研究本著充分利用材料的出發(fā)點(diǎn)，將叢生芽分為葉片上部、葉片中部、葉片下部和鱗莖片4個(gè)部分進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)葉片下部的誘導(dǎo)率最高，其次是鱗莖片，葉片中部和葉片上部較低。這是因?yàn)榘俸系恼T導(dǎo)效果具有位置效應(yīng)，總體來(lái)說(shuō)，誘導(dǎo)效果從下到上依次降低[18]，但本研究發(fā)現(xiàn)葉片下部誘導(dǎo)效果優(yōu)于鱗莖片，可能是跟品種不同有關(guān)。最佳的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-12,4-D +0.2 mg·L-16-BA +30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8，其中2,4-D的濃度達(dá)2.0 mg·L-1，可見(jiàn)高濃度的生長(zhǎng)素有利于愈傷組織的產(chǎn)生。在誘導(dǎo)愈傷時(shí)發(fā)現(xiàn)，愈傷產(chǎn)生后基本都會(huì)產(chǎn)生不定芽，表明百合不定芽的發(fā)育與愈傷組織生成之間并無(wú)顯著的階段分隔，有學(xué)者完成了百合外植體直接誘導(dǎo)成苗的研究[19]，可見(jiàn)百合的不定芽誘導(dǎo)是較為容易的。本研究在誘導(dǎo)不定芽時(shí)依然發(fā)現(xiàn)葉片下部顯著優(yōu)于鱗莖片，但在進(jìn)行百合種苗工廠(chǎng)化擴(kuò)繁時(shí)，還是建議將各類(lèi)外植體充分綜合利用。

在進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)化時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)較高的“分裂素/生長(zhǎng)素”比值處理CSY5(MS+5.0 mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1NAA )得到的增殖倍數(shù)要顯著高于較低“分裂素/生長(zhǎng)素”比值處理CSY1(MS+1.0 mg·L-16-BA +0.1 mg·L-1NAA)。但CSY1得到的叢生芽比較整齊，葉片寬大，且無(wú)根，利于后續(xù)增殖切割操作或進(jìn)一步進(jìn)行生根培養(yǎng)操作，這與夏九成等[20]和錢(qián)瓊秋等[21]研究一致。

東方百合‘索邦’的生根誘導(dǎo)相對(duì)比較容易，在愈傷誘導(dǎo)以及叢生芽誘導(dǎo)過(guò)程中由于添加生長(zhǎng)素，加之其內(nèi)源激素的影響均發(fā)現(xiàn)有根長(zhǎng)出，這與現(xiàn)有[21-23]研究一致，即IAA、IBA、NAA以及與BA、活性炭等的配合等均能夠誘導(dǎo)生根。本研究利用單一NAA作為生根誘導(dǎo)激素，不同濃度下生根均達(dá)到100%，但植株生長(zhǎng)受到一定影響。綜合考慮生根及植株的生長(zhǎng)狀態(tài)，選用SG3(MS+0.5 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8)作為生根培養(yǎng)基。煉苗移栽也是百合種苗生產(chǎn)的重要步驟，后續(xù)可進(jìn)一步深入研究，為百合種苗生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。