石 鵬，滕 柳，郭海波，王 慧

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

神經(jīng)甾體是一類存在于中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中，與神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關的一類甾體化合物。神經(jīng)甾體很早就被認為具有鎮(zhèn)靜、麻醉和抗癲癇的作用。神經(jīng)甾體是神經(jīng)興奮性的內源性調節(jié)因子，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)中合成的神經(jīng)甾體會通過非基因組機制影響CNS的興奮性[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中合成神經(jīng)甾體需要以膽固醇為原料，P450膽固醇側鏈裂解酶(P450 cholesterol side chain cleavage，P450scc)位于線粒體內膜，能將膽固醇催化形成孕烯醇酮(Pregnenolone，PREG)，是神經(jīng)甾體合成中的限速步驟，神經(jīng)甾體與細胞表面受體結合后，能快速改變神經(jīng)興奮性[2]。有關研究[3]表明，大麻素受體1(Cannabinoid receptor1，CB1R)、微管相關蛋白2(Microtubule-associated protein 2，MAP2)也是神經(jīng)甾體的作用靶點。CB1R在大腦中廣泛表達，PREG是CB1受體的負向別構分子，神經(jīng)甾體通過CB1R與焦慮、抑郁相關。PREG通過充當激動劑與MAP2特異性結合，在腦發(fā)育、突觸可塑性、抑郁中具有一定作用[4]。目前，學界認為中樞五羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)與皮層興奮性密切相關。5-HT與神經(jīng)甾體均能參與中樞興奮性的調節(jié)，但二者在中樞興奮性調節(jié)中的相互作用尚不清楚。對氯苯丙氨酸(Para-chlorophenyl alanine，PCPA)是色氨酸羥化酶的不可逆抑制劑，可以有效阻斷腦內5-HT的合成，降低腦內5-HT含量，廣泛應用于睡眠-覺醒研究中[5]。酸棗仁湯(Suanzaoren decoction，SZRD)是治療失眠的經(jīng)典方劑，研究顯示酸棗仁湯對參與睡眠-覺醒調節(jié)的單胺類神經(jīng)遞質和氨基酸類神經(jīng)遞質具有調控作用[6]。因此，本實驗通過大鼠腹腔注射PCPA，觀察大鼠腦內5-HT下降后，皮質P450scc、CB1R、MAP2 mRNA表達情況及酸棗仁湯的干預作用，探討5-HT與神經(jīng)甾體的相互作用關系，揭示酸棗仁湯治療失眠的潛在機制。

1 材料與試劑

1.1 動物

健康SPF級雄性SD大鼠50只，體質量(200±20)g，購買于長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：NO.SCXK(湘)2014-0011。在恒溫(22±2)℃、安靜的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1周，實驗期間自由攝食飲水。實驗條件符合貴州中醫(yī)藥大學動物倫理和實驗相關要求。

1.2 藥物儀器及試劑

PCPA(C-6506，Sigama公司)；酸棗仁湯(酸棗仁、川芎、茯苓、知母、炙甘草)于北京同仁堂貴陽店購買；旋轉蒸發(fā)器(RE-5203，上海亞榮生化儀器廠)；7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；超微量分光光度計(德國Implen公司)；Trizol(Invitrogen公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(賽默飛世爾科技有限公司)，RT-PCR引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 藥物準備

酸棗仁湯依據(jù)第五版《方劑學》教材：稱取酸棗仁18 g，知母10 g，茯苓10 g，川芎5 g，炙甘草3 g，10劑共460 g。加8倍水浸泡1 h，煎煮1 h，紗布濾過，藥渣加入6倍水煎煮30 min過濾藥液，合并兩次藥液旋蒸濃縮至含生藥量1.5 g/mL的濃縮藥液[7]，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，臨用時按需取用水浴復溫。

PCPA懸浮液配制：PCPA按350 mg/kg計算稱取用量[1]，置于研缽內間斷少量加入生理鹽水持續(xù)研磨30 min，配制成PCPA懸浮液，4 ℃保存?zhèn)溆?，使用前充分混勻?/p>

2.2 動物分組及給藥

大鼠隨機分為正常組、對照組、PCPA組、SZRD組、PCPA+SZRD組，每組10只。正常組不做任何處理，PCPA組和PCPA+SZRD組按350 mg/kg腹腔注射PCPA，對照及SZRD組腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次持續(xù)6天。第7天起SZRD組和PCPA+SZRD組以7.5 g/kg劑量，10 mL/kg體積灌胃SZRD，對照組和PCPA組灌胃等體積生理鹽水，每天1次持續(xù)8天。

2.3 取材

末次給藥2 h后，以10%水合氯醛 (300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，冰上迅速取出腦組織，去除腦干、嗅球，分離皮質置于標記好的預冷EP管中，液氮速凍，轉入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 引物設計

引物使用Primer5.0設計，上海生工生物技術服務有限公司合成，見表1。

表1 引物序列及大小

2.5 RNA提取，逆轉錄及RT-PCR反應條件

Trizol法提取總RNA，超微量分光光度計測定RNA濃度和純度，樣本純度均符合1.8～2.0標準，隨即按照逆轉錄試劑盒要求進行逆轉錄得到cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩T-PCR參照說明書采用20 μL體系，反應條件為：UDG酶激活50 ℃ 2 min，預變性95 ℃ 2 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 動物一般情況

PCPA腹腔注射3天后與對照組相比可見大鼠飲食減少，白天活動增加，攻擊性增強，皮毛無光澤，出現(xiàn)一系列腦內5-HT濃度下降表現(xiàn)[1]。

3.2 PCPA對大鼠大腦皮質P450scc、CB1R、MAP2 mRNA的影響

與對照組比較，PCPA組P450scc mRNA表達增加(P<0.05)，CB1R mRNA表達下降(P<0.01)，MAP2 mRNA表達降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義，見表2。

3.3 酸棗仁湯的干預作用

與PCPA組比較，PCPA+SZRD組P450scc mRNA表達降低(P<0.05)，CB1R mRNA表達增加(P<0.05)，MAP2 mRNA表達增加(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義。與對照組比較，SZRD組P450scc、CB1R、MAP2 mRNA表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表2。

4 討論

神經(jīng)甾體及其代謝產(chǎn)物在皮層興奮性、學習記憶、神經(jīng)保護等方面具有廣泛作用[8]。5-HT也與皮層興奮性關系密切，目前尚不明確5-HT和神經(jīng)甾體間的功能關系。PCPA是研究中樞5-HT與其他神經(jīng)遞質功能關系的經(jīng)典藥物[9]。本實驗結果顯示(表2)，PCPA能導致大鼠大腦皮質P450scc表達增加，CB1R、MAP2表達下降，酸棗仁湯能降低P450scc表達，上調CB1R、MAP2受體表達。對照組與正常組比較，P450scc、CB1R、MAP2表達無統(tǒng)計學差異，表明灌胃、腹腔注射等侵襲性操作對上述指標無明顯影響。

表2 各組大鼠皮質P450scc、MAP2、CB1受體mRNA表達情況

神經(jīng)甾體的合成和代謝過程需要多種酶的參與，P450scc是神經(jīng)甾體生成中關鍵的酶之一[10]。星形膠質細胞、少突膠質細胞均可表達P450scc[11]，其中P450scc mRNA主要表達于星形膠質細胞中。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質細胞數(shù)量眾多且分布廣泛，能調節(jié)神經(jīng)元的興奮性和突觸活動，與睡眠-覺醒關系密切，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和功能方面具有重要作用，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PCPA腹腔注射能激活星形膠質細胞，上調星形膠質細胞特異性標志物膠質原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)表達[12]。還有研究[13]顯示，在癲癇的病理過程中，星形膠質細胞轉化為反應性細胞并表達高水平的P450scc，從而成為神經(jīng)甾體合成的主要參與者。因此，筆者推測本實驗腹腔注射PCPA后上調的P450scc可能主要來源于激活后的反應性星形膠質細胞。另有研究[14]發(fā)現(xiàn)，孕期胎兒腦中具有較高濃度的神經(jīng)甾體物質，使得胎兒在孕期大部分時間都處于類似睡眠的行為狀態(tài)。本實驗中大鼠腦內5-HT含量下降后，P450scc表達增加可能意味著大鼠腦內神經(jīng)甾體含量的波動，這可能是導致睡眠-覺醒異常的原因，酸棗仁湯的干預作用可能是恢復腦內神經(jīng)甾體水平，其具體機制還有待深入研究。

目前學界認為，神經(jīng)甾體主要通過GABAA受體參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性的調節(jié)，神經(jīng)甾體作用于GABAA受體后能使其介導的Cl-通道開放，氯離子內流增加產(chǎn)生抑制性電流，參與中樞興奮性的調節(jié)，使神經(jīng)甾體在狂躁、焦慮、抑郁等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方面具有一定的臨床潛力[15]。CB1受體存在于GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元富集的區(qū)域且參與了信息傳遞過程，因此可以認為內源性大麻素系統(tǒng)能夠參與調控興奮或抑制性神經(jīng)傳遞，具有雙向調控作用[16]。有關研究[17]顯示，通過CB1受體介導的內源性大麻素信號傳導對于非快速眼動睡眠的穩(wěn)定是必要的。5-HT2C受體和CB1受體之間存在相互作用從而調控大鼠睡眠-覺醒模式[18]。本實驗結果顯示，PCPA導致CB1R表達下降，這也表明5-HT與CB1R在睡眠-覺醒調節(jié)中可能也存在相互作用，酸棗仁湯可能通過增加CB1R的表達影響皮層興奮性，其中的具體機制還有待進一步研究。

MAP2是調節(jié)微管蛋白組成的重要調節(jié)因子，在穩(wěn)定微管、神經(jīng)元發(fā)育、突觸可塑性等方面具有重要作用[19]。有學者[20]將MAP2作為神經(jīng)元正常結構的標志物，相關研究顯示，快速眼動睡眠剝奪后大鼠皮層MAP2表達減少且能觀測到髓鞘溶解等細胞超微結構異常，本實驗的結果也發(fā)現(xiàn)，PCPA組與對照組比較，MAP2表達下降。筆者研究團隊前期實驗發(fā)現(xiàn)，PCPA能導致大鼠腦內微透析液中谷氨酸的含量增加[21]，能上調大鼠大腦皮質中代謝型谷氨酸受體mGluR1、mGluR2的表達[22]，還能增加N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體的表達[23]。因此，可推測PCPA導致MAP2表達降低的機制可能是：過度激活的NMDA和代謝型谷氨酸受體，通過Ca2+通道導致Ca2+內流增加，胞內Ca2+超載等途徑引起的細胞毒性從而導致MAP2降解。

睡眠障礙可能增加多種心血管疾病及代謝性疾病的患病風險，是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題[24]。睡眠的調節(jié)與皮層興奮性調節(jié)密切相關，探究5-HT與神經(jīng)甾體的功能關系，有利于進一步明確皮層興奮性的調節(jié)機制，進而為失眠的治療提供新的治療靶點，酸棗仁湯可能通過調節(jié)P450scc、CB1R、MAP2的表達對失眠發(fā)揮治療作用，這可能是酸棗仁湯治療失眠的潛在機制之一。