徐國新，朱曉玨，王芳，陳龍

(1. 蘇州大學附屬張家港醫(yī)院檢驗科，江蘇 張家港 215600； 2. 張家港市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，江蘇 張家港 215600)

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi,S. Typhi)屬于腸桿菌科沙門菌屬，常通過污染的食物或水進入人體消化道，進而引起全身性的感染癥狀——傷寒熱[1-2]。傷寒沙門菌經(jīng)口攝入，經(jīng)胃酸、小腸高滲透壓等不利環(huán)境因素后侵入回腸、盲腸及結腸末端。鞭毛是細菌的動力裝置，在傷寒沙門菌致病過程中起著重要作用。鞭毛幫助細菌抵抗環(huán)境因素殺傷的同時，參與傷寒沙門菌對腸上皮細胞的侵襲[3]。傷寒沙門菌的鞭毛調(diào)控網(wǎng)絡復雜，受多種全局調(diào)控因子甚至非編碼RNA調(diào)控[4-6]。宿主整合因子(integration host factor，IHF)作為傷寒沙門菌的全局調(diào)控因子之一，含有HimA、HimD兩個亞基。IHF能調(diào)控傷寒沙門菌多種基因尤其是毒力基因的轉(zhuǎn)錄表達[7]。但是，IHF對于傷寒沙門菌動力的影響及鞭毛基因的調(diào)控作用仍不清楚。本研究通過分析IHF對鞭毛基因的調(diào)控作用，初步探討其對傷寒沙門菌動力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 傷寒沙門菌野生株(GIFU10007)、缺失株△himA、△himD為本實驗室保存；pBAD33質(zhì)粒由江蘇大學黃新祥教授惠贈；異源表達載體pBAD33用以構建載體himA-pBAD、himD-pBAD，分別轉(zhuǎn)化入△himA、△himD構建相應回補株himA-C、himD-C；空載體pBAD33轉(zhuǎn)化入野生株及缺失株作為空白對照。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoR Ⅰ及T4DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA標準參照物、反轉(zhuǎn)錄酶及嵌合熒光染料購自TaKaRa(大連)公司；高保真DNA聚合酶、TaqMix購自南京諾唯贊公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(美國Axygen公司)；氯霉素(美國Sigma公司)；PCR產(chǎn)物純化試劑盒(德國Qiagen公司)；Trizol試劑及RNA純化試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像系統(tǒng)(美國Gene公司，型號Gene Genius Bio Imaging System)；PCR儀(美國ABI公司，型號ABI 2700)；電轉(zhuǎn)化儀(美國Bio-rad公司，型號GENE PULSER Ⅱ)；熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司)；微量核酸分光光度計(美國Thermo公司，型號NanoDrop-1000)；引物由蘇州泓迅生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 回補株構建 以S. Typhi GIFU10007野生株作為模板，使用上游引物：5′-CGCTCGAGATGGCGCTTACAAAAGCTGA-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)與下游引物：5′-CGGAATTCTTACTCTTCTTTGGGCGA-3′(下劃線為EcoR Ⅰ酶切位點)PCR擴增得到himA的編碼區(qū)域序列，使用上游引物：5′-CGCTCGAGATGACCAAGTCAGAATTGAT-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)與下游引物：5′-CGGAATTCTTAACCGTAAATATTGGCGCGAT-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點)PCR擴增得到himD的編碼區(qū)域序列；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與異源表達載體pBAD33分別酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接成重組質(zhì)粒，PCR篩選陽性載體，測序驗證正確即成功構建回補質(zhì)粒；回補質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化導入傷寒沙門菌野生株，PCR驗證攜帶了重組質(zhì)粒的克隆，即構建成功回補株himA-C、himD-C。野生株導入pBAD33空質(zhì)粒作為對照，記為WT-pBAD。

1.2.2 動力實驗 接種WT-pBAD、△himA-pBAD、△himD-pBAD、himA-C、himD-C單克隆至2 mL LB肉湯，37 ℃，250 r/min振搖培養(yǎng)過夜；次日以1∶100轉(zhuǎn)接種于新鮮LB肉湯，250 r/min振搖培養(yǎng)約2 h至D(600 nm)≈0.4；加入阿拉伯糖(終濃度1 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h以誘導異源表達載體。取菌液1 μL接種于0.3%瓊脂半固體培養(yǎng)基(含1 mmol/L阿拉伯糖)孵育12 h；量取動力圈直徑，進行統(tǒng)計學分析；通過動力圈直徑比較細菌動力。

1.2.3 細菌總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 挑取單菌落WT-pBAD、△himA-pBAD、△himD-pBAD，接種至2 mL LB肉湯，37 ℃，250 r/min振搖培養(yǎng)過夜；以1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮LB肉湯，250 r/min振搖培養(yǎng)至D(600 nm)≈0.4；加入阿拉伯糖(終濃度1 mmol/L)誘導0.5 h；4 ℃，4 000 r/min，離心10 min收集細菌。用Trizol提取細菌總RNA，并用RNA純化試劑盒消化殘存的DNA，核酸分析儀分析提取的RNA濃度及純度；取4 μg RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應體系10 μL，反應條件：25 ℃、15 min，85 ℃、5 s。

1.2.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析鞭毛基因flhD、fliA和fljB反應體系20 μL，其中嵌合熒光染料預混液10 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA模版2 μL，雙蒸水6.4 μL，以上反應液配置均在冰上進行。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。利用2-△△Ct計算法得到mRNA相對表達量。所用引物序列如下：flhD上游引物5′-AGCGTTTGATCGTCCAG-3′，下游引物CGTCCACTTCATTGAGCA-3′；fliA上游引物5′-CGACCGATATGACGCTTTGC-3′，下游引物5′-TTCCCGCCACTCATCGTAAG-3′；fljB上游引物5′-CAACCGCTAGTGATTTAGTTT-3′，下游引物5′-CTGTCCCTGTAGTAGCCGTAC-3′；5S上游引物5′-TTGTCTGGCGGCAGTAGC-3′，下游引物5′-TTTGATGCCTGGCAGTTC-3′。每組實驗至少重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 傷寒沙門菌回補株himA-C和himD-C的構建

結果如圖1所示，成功構建含有himA、himD編碼片段的pBAD33回補質(zhì)粒，并經(jīng)測序驗證正確。將回補質(zhì)粒利用電轉(zhuǎn)化的方式導入相應基因缺失株，即成功構建回補株himA-C、himD-C。

1：PCR驗證；2：質(zhì)粒酶切驗證；M：DNA標準參照物

2.2 himA和himD缺失后對傷寒沙門菌動力的影響

動力實驗結果如圖2顯示，與WT-pBAD相比，△himA-pBAD與△himD-pBAD的動力圈直徑明顯減小(t=14.00，10.58，P均<0.05)，himA-C、himD-C的動力圈與WT-pBAD基本一致，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果表明，himA和himD對傷寒沙門菌的動力起促進作用。

2.3 himA和himD對傷寒沙門菌鞭毛基因mRNA表達的影響

qRT-PCR結果如圖3顯示，△himA-pBAD中鞭毛基因flhD、fliA、fljB的mRNA表達水平均明顯低于WT-pBAD(t=9.55，8.1，11.25，P<0.05或<0.01)；△himD-pBAD中flhD、fliA、fljB的mRNA表達水平同樣明顯低于WT-pBAD(t=10.2，8.1，12.5，P<0.05或<0.01)。由此表明，himA和himD均能夠正向調(diào)節(jié)傷寒沙門菌鞭毛基因flhD，fliA和fljB等mRNA表達。

圖2 傷寒沙門菌動力實驗

圖3 qRT-PCR檢測各菌株中鞭毛基因flhD，fliA和fljB的mRNA表達

3 討論

IHF作為全局調(diào)控因子，在多種細菌的基因調(diào)控網(wǎng)絡中起重要重用，參與致病進程。在新月柄桿菌中，IHF抑制細菌動力；在大腸埃希菌和鼠傷寒沙門菌中，IHF激活細菌動力[8-9]。傷寒沙門菌是一種具有雙相鞭毛革蘭陰性菌，其鞭毛的構成及功能有特殊性[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺失himA或himD后，傷寒沙門菌動力明顯減弱，表明IHF能夠促進傷寒沙門菌的動力。

鞭毛是細菌重要的動力器官，在致病過程中發(fā)揮重要功能，如細菌定植和侵襲、感染位點的維持、感染后的擴散等[11]。傷寒沙門菌鞭毛的調(diào)控機制復雜，有50余個基因參與鞭毛的合成，按照轉(zhuǎn)錄調(diào)控級別可分為三級。本研究選取的flhD、fliA和fljB分別屬于傷寒沙門菌的一、二、三級鞭毛基因，其中fljB為傷寒沙門菌GIFU10007所特有H:z66的編碼基因[10]。本研究結果顯示，himA和himD均能夠正向調(diào)節(jié)傷寒沙門菌鞭毛基因flhD，fliA和fljB等mRNA表達。

調(diào)控因子對靶基因的調(diào)節(jié)方式有直接與間接兩種方式，前者是指調(diào)控因子能夠直接結合到靶基因的啟動子序列，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄；后者則通過調(diào)節(jié)其他調(diào)控因子，影響靶基因轉(zhuǎn)錄[12]。后續(xù)研究中，我們將表達IHF蛋白，分析IHF對于鞭毛基因的調(diào)控方式。

綜上所述，本研究初步揭示宿主整合因子IHF能夠增強傷寒沙門菌的動力，并正向調(diào)節(jié)鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄。