李洋，余江南，徐希明

(江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

脊髓損傷是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病，對患者身心均造成嚴重創(chuàng)傷。其發(fā)病率高、繼發(fā)反應復雜、治愈率低，一直是全世界范圍內(nèi)急需攻克的醫(yī)學難題[1]。目前的治療策略主要是抑制膠質(zhì)瘢痕的產(chǎn)生、促進神經(jīng)細胞再生以及重構(gòu)創(chuàng)傷部位的微環(huán)境[2-3]。已有報道腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)對脊髓損傷有明顯的修復作用[4-5]。BDNF通過作用于全長型酪氨酸受體激酶B發(fā)揮神經(jīng)保護、炎性因子調(diào)節(jié)等作用[6-7]。然而BDNF在體內(nèi)易失活從而難以發(fā)揮持續(xù)滋養(yǎng)受損部位的作用，因此構(gòu)建BDNF緩釋釋藥體系有利于藥物應用。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic acid-glycolic acid),PLGA]是組織工程領(lǐng)域中應用廣泛的生物材料[8]，具有良好的生物相容性[9]，PLGA納米?？商岣呱L因子的穩(wěn)定性以及實現(xiàn)藥物的緩釋[10]。

本研究采用復乳化溶劑揮發(fā)法制備BDNF-PLGA納米粒，利用正交試驗設(shè)計優(yōu)化制備工藝，最后對制得樣品進行表征及生物相容性評價。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

PLGA(75∶25)相對分子質(zhì)量為24 000～38 000(濟南岱罡生物科技有限公司)；聚乙烯醇，相對分子質(zhì)量13 000～23 000(日本可樂麗公司)；甘露醇、蔗糖(國藥試劑)；超高速離心機(美國 Beckman公司)；冷凍干燥機(德國CHRIST公司)；動態(tài)光散射及Zeta電位測定儀(德國Bruke公司)；透射電鏡(日本日立公司)；BCA蛋白定量試劑盒及BDNF-ELISA試劑盒(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司)；BDNF(美國Peprotech公司)；酶標儀(美國BioTek公司)。

1.2 BNDF-PLGA納米粒的制備

配制二氯甲烷/丙酮=3∶1(體積比)混合溶液，稱取PLGA粉末，溶解于上述溶液中，獲得PLGA溶液。精密稱取蛋白藥物，加入1 mL滅菌水配制成水溶液，按蛋白溶液/PLGA溶液=1∶5(體積比)，緩慢將蛋白水溶液滴加入PLGA的混合溶液中制得初乳，滴加過程中磁力攪拌使之分散均勻，然后100 W超聲2 min，然后攪拌轉(zhuǎn)移至聚乙烯醇溶液中，超聲分散至溶液顯乳白色。敞口磁力攪拌4 h揮干有機溶劑。離心清洗3次，將微球分散于20 mL超純水中，冷凍干燥后備用。

1.3 正交試驗優(yōu)化BNDF-PLGA納米粒的制備條件

以牛血清白蛋白(BSA)為模型藥物，選取4個對PLGA納米粒制備結(jié)果影響較大的因素：A為制得初乳與聚乙烯醇溶液的體積比；B為投藥量與PLGA用量質(zhì)量比；C為外水相聚乙烯醇溶液的質(zhì)量濃度(g/L)；D為超聲時間(min)。以載藥率(S1)、包封率(S2)作為指標，優(yōu)化制備工藝。正交設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.4 BNDF-PLGA納米粒的表征

1.4.1 平均粒徑、粒徑分布和Zeta電位的測定 將制備的納米粒加入雙蒸水中，分散均勻至無明顯渾濁，置于動態(tài)光散射及 Zeta 電位測試儀測定粒徑大小和Zeta電位。

1.4.2 納米粒的形態(tài)考察 將稀釋好的樣品滴于銅網(wǎng)上，用質(zhì)量濃度為30 g/L的磷鎢酸溶液負染3 min，室溫干燥后于透射電鏡下觀察PLGA納米粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.5 PLGA納米粒中藥物包封率、載藥率和回收率的測定

1.5.1 包封率測定 收集制備過程中離心的上清液，按“1.5.3”所述方法測量其中未包載的藥物量，計算出納米粒的包封率。系統(tǒng)中上清液中的藥物含量記作W1，投入藥物總量記作W0，則包封率=(W0-W1) / W0×100%。

1.5.2 載藥量測定 稱取5 mg的納米粒，加入1.0 mL二氯甲烷溶解納米粒釋放藥物，再用1.0 mL滅菌水萃取納米粒中的蛋白質(zhì)，加入0.5 g無水硫酸鈉顆粒，離心萃取上清液3次，收集3次的萃取液。測定其中蛋白的含量。

1.5.3 樣品含量的測定 采用BCA法檢測BSA含量。配制系列濃度蛋白標準品溶液，96孔板中加入稀釋好的待測樣品和標準品溶液，加入測定工作液后混合均勻，避光37 ℃孵育30 min，于波長562 nm處檢測光密度(D)值。以D值(Y)對標準品濃度(X)作線性回歸，得標準曲線并計算樣品對應濃度。配制濃度為 5、30、100 μg/mL的BSA溶液各3份，按照BCA法相同步驟操作，于562 nm測定D值，計算回收率。

BDNF含量采用ELISA試劑盒檢測，在包被有BDNF抗體的酶標板中加入標準品和樣品，設(shè)空白對照孔，于37 ℃孵育30 min，洗板后除空白孔外，均加入酶標試劑置于37 ℃孵育30 min，再次洗板拍干，加入顯色液A瓶、B瓶，避光37 ℃孵育15 min，最終加入終止液，測定波長450 nm處D值。以D值對標準品濃度(C)作線性回歸，得標準曲線并計算樣品對應濃度。

1.6 PLGA納米粒體外釋放度的測定

精密稱取制備的PLGA納米粒2 mg，用PBS稀釋后，置于透析袋中進行體外釋放試驗。恒溫水浴振蕩器設(shè)定為37 ℃，100 r/min，于4、6、12、24、48、72、168、240、288、360 h等時間點取樣，并補回等量緩沖鹽溶液。BSA-PLGA納米粒和BDNF-PLGA納米粒按照“1.5.3”中操作步驟測定含量，并作累積釋放曲線圖。

1.7 PLGA納米粒細胞相容性測定

1.7.1 細胞培養(yǎng) 將大鼠外胚層間充質(zhì)干細胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)按 3×105個/瓶培養(yǎng)于含有5 mL細胞培養(yǎng)液、10%胎牛血清的D/F12培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(飽和濕度95%、5%CO2、37 ℃)孵育。根據(jù)細胞生長狀況以及培養(yǎng)液pH 值變化，1～2 d換液1次，待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時進行傳代。

1.7.2 細胞增殖實驗 細胞于96孔板中貼壁培養(yǎng)后，更換為含有PLGA納米粒的新鮮培養(yǎng)基，在規(guī)定的時間點，孔中細胞用PBS洗滌2次，在37 ℃下用含10% Alamar Blue的新鮮培養(yǎng)基避光孵育4 h。在波長590 nm處測量上清液的D值，以第1天的D值為基礎(chǔ)計算相對增殖速度。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 正交試驗設(shè)計結(jié)果

以制備納米粒的包封率(S1)和載藥量(S2)為指標，S=S1+S2。運用L9(34)正交表進行實驗設(shè)計，結(jié)果如表2所示。由極差分析可知，各因素的影響大小為B>C>A>D，且由表3中方差分析的結(jié)果可知，影響因素A、B、C對制備結(jié)果有顯著影響(P<0.05),而D因素影響不顯著。最佳的制備條件為A3B3C1D3，即制備初乳和外水相的體積比為1∶15，投藥量與PLGA用量質(zhì)量比為6∶100，聚乙烯醇溶液的質(zhì)量濃度為10 g/L，超聲時間為5 min。

表2 正交試驗設(shè)計和結(jié)果

表3 方差分析

2.2 最佳工藝驗證

按2.1項中優(yōu)化的最佳處方工藝平行制備3批BSA-PLGA納米粒，按照BSA試劑盒中蛋白含量的測定方法，得標準曲線為Y=0.000 2X+0.068(R2=0.992 1)，計算出包封率為(78.65±3.18)%，載藥量為(3.25±0.71)%，回收率為(98.48±0.20)%。

2.3 BDNF-PLGA納米粒表征結(jié)果

透射電鏡結(jié)果顯示BDNF-PLGA納米粒形狀規(guī)整，呈均勻球形包載藥物，如圖1(A)所示；經(jīng)動態(tài)光散射及Zeta電位儀測定，BDNF-PLGA納米粒粒徑為(205±0.18)nm，粒徑分布圖見圖1(B)，多分散系數(shù)為(0.132±0.02)，電位為-23.51 mV。BDNF含量測定標準曲線為D=0.042 2C+0.090 5(R2=0.990 4)，計算得出納米粒的包封率為(79.65±2.14)%，載藥量為(0.002 381±0.000 253)%。

2.4 載藥納米粒的體外釋放曲線

BSA-PLGA納米粒和BDNF-PLGA納米粒的釋放結(jié)果如圖2所示。前4 h兩種納米粒的累積釋放率分別為(18.23±2.31)%、(17.48±2.22)%，未出現(xiàn)突釋效應；在6～72 h內(nèi)，BSA-PLGA納米粒和BDNF-PLGA納米粒每小時藥物釋放率為0.60%和0.50%，表現(xiàn)為緩慢釋放；72～360 h時納米粒釋放趨近平緩，最終兩者累積釋放率分別為(82.15±1.23)%和(88.32±1.23)%。

A：BDNF-PLGA透射電鏡圖；B：BDNF-PLGA納米粒粒徑分布

圖2 載藥納米粒體外累積釋放曲線

2.5 納米粒的細胞增殖實驗

如圖3所示，前24 h內(nèi)BDNF-PLGA納米粒組、BDNF溶液組及空白對照組細胞增殖速率無顯著性差異(P>0.05)；隨后BDNF-PLGA納米粒和BDNF溶液均顯示出促進細胞增殖的作用，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但納米粒組與BDNF溶液組無顯著差異。結(jié)果表明BDNF-PLGA納米粒能促進EMSCs增殖。

*：P<0.05,與對照組比較

3 討論

BDNF具有促進干細胞向神經(jīng)元分化、抑制炎癥反應、促進神經(jīng)元存活和改善軸突再生的作用[11-12]。已有不少報道其用于修復動物脊髓損傷模型[13-14]。然而蛋白類的藥物易失活，穩(wěn)定性差，不利于在損傷處長期而持續(xù)地發(fā)揮療效[15]。PLGA是常見的生物可降解材料，其應用形式主要有薄膜、多孔支架、微球及納米粒等。PLGA的降解產(chǎn)物二氧化碳、水和羥基乙酸無毒害作用，可排出體內(nèi)，并且可通過對材料的改性和修飾[16]，達到緩釋[17]、控釋藥物[18]的目的，是構(gòu)建新型藥物遞送系統(tǒng)的理想材料。

目前，制備PLGA納米粒的常用方法有單/復乳溶劑揮發(fā)法、同軸靜電噴霧法、納米沉淀法等。其中復乳化溶劑揮發(fā)法操作簡便，易于重復，可用于親水性藥物如蛋白質(zhì)類藥物的制備[19]。本實驗采用復乳化法制備BDNF-PLGA納米粒，可減少蛋白質(zhì)類藥物的失活。

本研究通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化PLGA納米粒的制備工藝，以藥物包封率和載藥量為評價指標，方差分析結(jié)果顯示，初乳和外水相的體積比、投藥量與PLGA用量質(zhì)量比、聚乙烯醇溶液濃度是影響納米粒制備的主要因素，超聲時間對結(jié)果的影響不顯著。根據(jù)正交試驗結(jié)果顯示，投藥量與PLGA用量質(zhì)量比對藥物的包封率和載藥量影響較大。一方面PLGA占比越大，可增加有機相的黏度從而抑制藥物彌散；另一方面，增加PLGA用量加速微球的固化，可減少包載藥物的流失[20]。外水相聚乙烯醇溶液的作用主要是固化制備的初乳，沉淀出粒徑均一的納米粒。聚乙烯醇濃度不足可能導致乳液破相而使載藥量降低。此外，已有報道證明[21]，調(diào)節(jié)初乳/外水相的比例對制備樣品的載藥量和包封率有顯著影響，并可降低藥物的突釋現(xiàn)象。提高外水相的比例，可起到稀釋溶劑的效果[22]。綜合極差分析與方差分析所得最優(yōu)制備條件為初乳和外水相的體積比為1∶15，投藥量與PLGA用量質(zhì)量比為6∶100，聚乙烯醇溶液質(zhì)量濃度為10 g/L。

通過對優(yōu)化條件進行驗證，實驗所制備的BDNF納米粒形態(tài)粒徑均一，有較高的包封率，滿足后續(xù)實驗要求。制得樣品形態(tài)完整，在對納米粒釋放藥物能力的研究中，前4 h未出現(xiàn)藥物泄露而導致突釋效應；中期隨著外層載體PLGA的逐漸溶解，內(nèi)層藥物BDNF逐漸擴散至介質(zhì)中，直至最后平穩(wěn)達到釋放平衡，累積釋放率為(88.32±12.3)%。乳化法制備PLGA納米粒包載蛋白藥物的包封率有限，不少研究者在制備該劑型時包封率不高，如趙鶯歌[23]制備胰島素的PLGA緩釋納米粒，包封率僅為36.61%；不僅如此，制備其他非蛋白類的藥物如熊果酸[24]、磷酸二酯酶-4(PDE-4)抑制劑阿普斯特(Apremilast)[25]等，所獲得的包封率也僅為約54%、61.1%。本實驗通過考察影響納米粒包封率的幾個因素，進行正交設(shè)計優(yōu)化后，最終制得包封率為79.65%的納米粒，與以往的研究相比有較大的提升。

細胞增殖實驗結(jié)果表明BDNF納米粒對細胞的生長增殖無抑制作用，可維持EMSCs細胞的正常生長，說明BDNF納米粒具有良好的生物相容性。

綜上所述，本實驗通過復乳化溶劑揮發(fā)法制備BDNF-PLGA納米粒，并利用正交試驗設(shè)計優(yōu)化制備工藝，最終制得的樣品性質(zhì)穩(wěn)定。經(jīng)體外研究顯示，BDNF-PLGA納米粒具有緩釋效果和良好的生物相容性。然而本研究僅對BDNF-PLGA納米粒的制備工藝和性質(zhì)進行了探討，后續(xù)將進一步探討其在干細胞分化以及脊髓損傷修復中的應用價值。