張明暉，趙妍，孫雅麗，魏海波，楊春潔

赤峰市醫(yī)院腫瘤內(nèi)三科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000

晝夜節(jié)律是由一組基因節(jié)律性表達(dá)形成的24 h周期振蕩的自主調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋回路。Michael Rosbash等因發(fā)現(xiàn)調(diào)控晝夜節(jié)律的分子機(jī)制并分離得到節(jié)律基因，獲得了2017年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。晝夜節(jié)律基因不僅控制晝夜節(jié)律，而且還調(diào)節(jié)生物體的生理機(jī)能和行為，如睡眠、攝食行為、體溫和血壓、激素分泌等。研究發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律的異常表達(dá)與人類多種疾病有關(guān)，如腫瘤。有研究報(bào)道，晝夜節(jié)律基因的破壞會(huì)導(dǎo)致某些惡性腫瘤的發(fā)生率提高，如乳腺癌、肺癌。乳腺癌是女性發(fā)病率最高的腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康。本研究通過統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息方法探討節(jié)律基因在乳腺癌中的表達(dá)變化、甲基化和突變的改變，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 節(jié)律基因表達(dá)數(shù)據(jù)的獲取

首先從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載基因功能注釋文件，并通過搜索關(guān)鍵詞“Rhythm/Circadian”篩選出與晝夜節(jié)律功能相關(guān)的184個(gè)基因。再通過NCBI-Gene數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行檢索，并通過 NCBI-PubMed（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）數(shù)據(jù)庫(kù)搜索已有文獻(xiàn)證實(shí)的基因。最終確定了32個(gè)節(jié)律基因。從癌癥基因組譜數(shù)據(jù)庫(kù)（TCGA，https：//www.cancer.gov/）中獲取節(jié)律基因在乳腺癌中的表達(dá)數(shù)據(jù)，其中乳腺癌數(shù)據(jù)中有1109個(gè)腫瘤組織樣本和113個(gè)正常組織樣本。

1.2 節(jié)律基因甲基化和突變數(shù)據(jù)的獲取

從MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)（https://bigd.big.ac.cn/databasecommons/database/id/120）中獲得乳腺癌節(jié)律基因的甲基化數(shù)據(jù)，并用

t

檢驗(yàn)分析腫瘤樣本和正常樣本中節(jié)律基因的甲基化差異性。從cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.cbioportal.org/）中收集乳腺癌節(jié)律基因的突變數(shù)據(jù)，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因在乳腺癌樣本中的突變率。甲基化差異表達(dá)用R語(yǔ)言ggplot2程序包繪制，腫瘤樣本節(jié)律基因突變情況用Graphpad軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 節(jié)律基因在乳腺癌中的突變情況

獲取乳腺癌樣本節(jié)律基因突變數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中大多數(shù)節(jié)律基因均顯示出高突變率，以突變率超過0.5%作為顯著突變的標(biāo)準(zhǔn)，超過30%的節(jié)律基因在乳腺癌中都發(fā)生了顯著突變，如：酪蛋白激酶1E（casein kinase 1 epsilon，CSNK1E）、纖溶酶原激活物抑制劑1型（serpin family E member 1，SERPINE1）、周期節(jié)律蛋白2（neuronal PAS domain protein 2，NPAS2）、周期基因3（period 3，PER3）、PER2、PER1、永恒蛋白基因（timeless circadian regulator，TIMELESS）、核受體亞家族1D組成員1（nuclear receptor subfamily 1，groupD，member 1，NR1D1）、生物鐘基因（clock circadian regulator，CLOCK）、視蛋白 4（opsin 4，OPN4）。其中，

PER2

在乳腺癌中突變率較高，高達(dá)1%。（圖1）

圖1 乳腺癌中節(jié)律基因的突變情況

2.2 節(jié)律基因的異常甲基化情況

對(duì)獲取的乳腺癌樣本和正常樣本中的節(jié)律基因表達(dá)數(shù)據(jù)利用

t

檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)節(jié)律基因在乳腺癌樣本中呈低表達(dá)，如：隱花色素蛋白2（cryptochromecircadian regulator2，CRY2）、

NR1D1

、

CSNK1E

、去乙?；?（sirtuin type 1，SIRT1）、早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子 3（recombinant early growth response protein 3，EGR3）、

CRY1

、

PER1

、視黃醇類核內(nèi)受體A（retinoic acid receptor-related orphan receptor A，RORA）、

RORB

、

NR1D2

、堿性-螺旋環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子E41（basic-helix-loop-helix transcriptional factor E41，BHLHE41）、前動(dòng)力蛋白 2（prokineticin 2，PROK2）、褪黑素受體 1A（melatonin receptor 1A，MTNR1A）、

CLOCK

、

PER3

、類芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like，ARNTL）、

OPN4

、核因子白細(xì)胞介素3調(diào)控蛋白（nuclear factor,interleukin 3 regulated，NFIL3）、

KIAA1737

。甲基化分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)節(jié)律基因在乳腺癌樣本中呈高甲基化，如：

NPAS2

、晝夜節(jié)律相關(guān)轉(zhuǎn)錄抑制因子（circadian associated repressor of transcription，C1orf51）、褪黑素受體 1B（melatoninreceptor1B，MTNR1B）、

CSNK1E

、

SIRT1

、

PER1

、

RORA

、

RORB

、

BHLHE41

、

PROK2

、

MTNR1A

、

SERPINE1

、

PER3

、

ARNTL

。（圖2）

圖2 乳腺癌中節(jié)律基因表達(dá)和甲基化水平

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在女性中居第一位，病死率居第二位，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響女性身心健康的重要疾病。目前乳腺癌的診斷和治療取得不斷進(jìn)展，使乳腺癌患者的總生存期不斷延長(zhǎng)。然而乳腺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制目前尚未完全了解，導(dǎo)致對(duì)其針對(duì)性較強(qiáng)的治療方法較少。與大部分的惡性腫瘤相同的是，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展也是在非常復(fù)雜的多種因素共同作用下出現(xiàn)的。研究表明，乳腺癌的發(fā)生與初潮和絕經(jīng)年齡、腫瘤家族史、肥胖等因素有關(guān)。乳腺癌是受多種基因參與調(diào)控的一種多步驟、多階段的復(fù)雜生物學(xué)演變過程。進(jìn)行較新的腫瘤相關(guān)基因探索，揭示其具體調(diào)控機(jī)制，可以為臨床腫瘤及其相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)及思路，對(duì)治療策略以及路徑均有十分重要的臨床意義。

晝夜節(jié)律的異常表達(dá)與腫瘤有關(guān)。節(jié)律基因在腫瘤發(fā)展中的作用研究正趨于成熟。第一，有研究顯示晝夜節(jié)律基因的破壞會(huì)導(dǎo)致某些惡性腫瘤的發(fā)生率提高。第二，有研究表明，在人類許多腫瘤類型中節(jié)律基因異常表達(dá)，如芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白樣1（aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocation protein like 1，BMAL1）在肝癌中表達(dá)增加；膠質(zhì)瘤中

PER2

異常甲基化導(dǎo)致表達(dá)改變。

Ck1δ

和

Ck1ε

的突變與許多腫瘤的發(fā)生率提高相關(guān)。第三，節(jié)律基因的表達(dá)改變調(diào)控腫瘤的發(fā)展。例如，

Dec1

、

Dec2

和

PER1

的異常表達(dá)對(duì)惡性上皮細(xì)胞的增殖和遷移起到重要作用，破壞PER2的表達(dá)可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡變。本研究通過公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的乳腺癌數(shù)據(jù)對(duì)節(jié)律基因的表達(dá)和功能進(jìn)行了全面和系統(tǒng)的分析，結(jié)果表明在乳腺癌中節(jié)律基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，大多數(shù)節(jié)律基因均顯示出高突變率，約超過30%的節(jié)律基因在乳腺癌中發(fā)生顯著突變，其中

PER2

在乳腺癌中突變率高達(dá)1%。這些結(jié)果表明節(jié)律基因在乳腺癌中的高突變率，有可能是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生的重要原因。同時(shí)對(duì)獲取的乳腺癌樣本和正常樣本中的節(jié)律基因表達(dá)數(shù)據(jù)利用

t

檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)節(jié)律基因在乳腺癌樣本中呈低表達(dá)，甲基化分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)節(jié)律基因在腫瘤樣本中呈高甲基化，這可能是由于乳腺癌樣本中節(jié)律基因的異常高甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)水平的降低，表明這些節(jié)律基因在乳腺癌中的表達(dá)發(fā)生改變。這項(xiàng)研究不僅全面了解節(jié)律基因在乳腺癌中的變化，而且可能為乳腺癌的診斷和治療提供新的思路和方法。