賈瀟，李照見，李延森，李春梅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院家畜環(huán)境控制與智慧生產(chǎn)研究中心，江蘇 南京 210095)

精氨酸是條件性必需氨基酸，在自然環(huán)境下主要以D-精氨酸和L-精氨酸兩種異構(gòu)體的形式存在。在動物機(jī)體內(nèi)，精氨酸以L-精氨酸的形式發(fā)揮功能，是目前發(fā)現(xiàn)的動物細(xì)胞內(nèi)功能最多的氨基酸。精氨酸是NO和多胺等生物活性因子的前體物質(zhì)[1]，對調(diào)控動物的生產(chǎn)、繁殖有重要作用。有研究表明，精氨酸具有緩解氧化應(yīng)激，增強(qiáng)畜禽抗氧化應(yīng)激的功能[2]。此外，Holt等[3]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)9 d攝入缺乏精氨酸的食物會導(dǎo)致男性的精子數(shù)量和活力降低。這些研究表明，精氨酸在精子發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，適當(dāng)增加精氨酸的供給可以提高雄性的生殖功能。

在雄性的睪丸發(fā)育過程中，分散在生精小管間的間充質(zhì)細(xì)胞會分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞，并分泌雄激素[4]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要分泌睪酮，動物體內(nèi)95%左右的睪酮是由睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的[5]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育不良或增生時會引起多種疾病。有研究表明，睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育不良會導(dǎo)致雄激素分泌減少，影響睪丸下降到腹部及腹股溝階段，最終導(dǎo)致隱睪的發(fā)生[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境高溫可引起公豬睪丸組織細(xì)胞凋亡和氧化損傷[7]。本研究選取小鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞系(MLTC-1)，探究熱處理對MLTC-1細(xì)胞的損傷以及L-精氨酸的緩解作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MLTC-1細(xì)胞系購自中喬新舟；L-精氨酸(CAS:74-79-3；純度>99%)購自希杰(上海)商貿(mào)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；RT-PCR定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(羥胺法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒(可見光法)、MTT檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將細(xì)胞分為4組，分別為對照組(C)、熱處理組(HT)、5 μg/mLL-精氨酸+熱處理組(5H)和10 μg/mLL-精氨酸+熱處理組(10H)。將細(xì)胞接種于六孔板中，每孔1×106個細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后(若細(xì)胞較少，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間)，更換為分別含精氨酸0、5、10 μg/mL的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換含0.1 U/mL hCG的RPMI 1640培養(yǎng)基，C組繼續(xù)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，0H、5H和10H組放入42 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，收集上清和細(xì)胞備用。

1.2.2L-精氨酸對MLTC-1細(xì)胞活力的影響

將細(xì)胞分為6組，接種于96孔板中，每孔2 000個細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別加入含 0、10、20、40、80、160 μg/mL精氨酸的培養(yǎng)基，孵育6、12、24 h后，采用MTT法測定細(xì)胞活力。檢測方法參照MTT細(xì)胞活力檢測試劑盒說明書。

1.2.3L-精氨酸添加量篩選

將細(xì)胞分為5組，即對照組(C)、熱處理組(HT)、5 μg/mLL-精氨酸+熱處理組(5H)、10 μg/mLL-精氨酸+熱處理組(10H)和20 μg/mLL-精氨酸+熱處理組(20H)，接種于96孔板中，每孔2 000個細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，將分別含L-精氨酸 0、5、10、 20 μg/mL的培養(yǎng)基加入到對應(yīng)組中，孵育5 h后，將HT組、5H組、10H組和20H組移入42 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中熱處理1 h，然后更換為不含血清的培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下恢復(fù)6 h，然后用MTT細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒檢測細(xì)胞存活率。

1.2.4 細(xì)胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

將細(xì)胞按試驗(yàn)設(shè)計(jì)處理完畢后，棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR測定。試驗(yàn)中所用引物序列如表1。

表1 引物序列

1.2.5 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)將細(xì)胞處理完畢后，將細(xì)胞和上清液收集在同一離心管中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

1.2.6 抗氧化指標(biāo)的測定

使用GSH-PX測定試劑盒，采用可見光法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH-PX的活力；使用T-SOD測試盒，采用羥胺法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中T-SOD的活力。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)首先用WPS表格進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)整理，然后使用SPSS 20以及Graphpad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-way ANOVA和LSD多重比較法進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 精氨酸對MLTC-1細(xì)胞活力的影響

為確定L-精氨酸的處理時間以及添加量，本試驗(yàn)采用了MTT法測定了不同時間點(diǎn)(6、12和24 h)以及不同濃度(0、10、20、40、80和160 μg/mL)下MLTC-1細(xì)胞的存活率。如圖1所示，處理時間為6 h，與對照組相比，L-精氨酸添加量為10 μg/mL時細(xì)胞活力顯著上升(P<0.05)，添加量為80 μg/mL時細(xì)胞活力極顯著下降(P<0.01)；當(dāng)細(xì)胞處理時間為12 h時，不同濃度精氨酸對細(xì)胞活力呈下降趨勢，并且添加量為40、80、120 μg/mL時，細(xì)胞存活率極顯著下降(P<0.01)；當(dāng)處理時間為24 h時，所有精氨酸濃度處理下，細(xì)胞活力均極顯著下降(P<0.01)。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，根據(jù)結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)細(xì)胞確定處理時間為6 h。

*表示與C組(0 μg/mL)相比差異顯著，P<0.05；**表示與C組相比差異極顯著，P<0.01

2.2 L-精氨酸添加量的篩選

如圖2所示，熱處理降低了MLTC-1細(xì)胞活力，當(dāng)添加不同濃度(0、5、10和20 μg/mL)L-精氨酸處理后，細(xì)胞活力呈上升趨勢，但是隨著精氨酸濃度的增加，細(xì)胞活力又成下降趨勢。當(dāng)L-精氨酸添加量為5 μg/mL時，細(xì)胞活力恢復(fù)到和C組差不多水平。所以，確定L-精氨酸添加量為5和10 μg/mL。

圖2 L-精氨酸對熱處理MLTC-1細(xì)胞活力的影響

2.3 L-精氨酸對熱處理MLTC-1細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響

如圖3所示，與對照組(C組)相比，熱處理極顯著降低了MLTC-1細(xì)胞GSH-Px活力(P<0.01)，當(dāng)L-精氨酸添加量為10 μg/mL時，與熱處理組(HT)相比，GSH-Px活力極顯著提高(P<0.01)。

2.4 L-精氨酸對熱處理MLTC-1細(xì)胞凋亡的影響

如圖4所示，與對照組(圖4A)相比熱處理后，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞比例增加(圖4B)；分別添加5 μg/mL(圖4C)和10 μg/mL(圖4D)L-精氨酸處理后，與熱處理組(圖4B)相比，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞比例減少。

A. GSH-Px活力；B. T-SOD活力。*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。下同

A. C組；B. HT組；C. 5H組；D. 10H組

2.5 L-精氨酸對熱處理MLTC-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖5所示，與HT組相比，添加L-精氨酸處理后，PI3K、Akt和Bcl-2的基因表達(dá)均呈上升趨勢，當(dāng)L-精氨酸添加量為5 μg/mL時，PI3K和Bcl-2基因表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。

2.6 L-精氨酸對熱處理MLTC-1細(xì)胞睪酮合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖6所示，與對照組(C組)相比，熱處理(HT)使StAR基因表達(dá)顯著增加(P<0.05)。添加L-精氨酸處理后，StAR、SF-1、Hsd3b1和Cyp17a1基因表達(dá)均呈上升趨勢，當(dāng)L-精氨酸添加量為5 μg/mL時，與HT組相比，SF-1基因表達(dá)顯著增加(P<0.05)，StAR和Cyp17a1基因表達(dá)極顯著增加(P<0.01)；當(dāng)L-精氨酸添加量為10 μg/mL時，與HT組相比，StAR基因表達(dá)極顯著增加(P<0.01)。

A. PI3K mRNA；B. AKT mRNA；C. Bcl-2 mRNA；D. Bax mRNA

A. StAR mRNA；B. SF-1 mRNA；C. Hsd3b1 mRNA；D. Cyp17a1 mRNA

3 討論

精氨酸是一種條件必需氨基酸，在機(jī)體內(nèi)，主要以L-精氨酸的形式發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)攝入缺乏精氨酸的食物會導(dǎo)致男性的精子數(shù)量和活力降低[3]。Srivastava[8]研究發(fā)現(xiàn)，L-精氨酸可以增加精子活力。也有研究表明，高濃度L-精氨酸對細(xì)胞有毒性。Silva等[9]發(fā)現(xiàn)高濃度L-精氨酸在體外受精下對牛精子可能有毒性作用。本研究對L-精氨酸的處理時間和濃度進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，處理時間6 h時，MLTC-1細(xì)胞活力較高，12 h和24 h時細(xì)胞活力反而顯著下降；熱處理后，MLTC-1細(xì)胞活力下降，當(dāng)L-精氨酸添加量為5 和10 μg/mL時，細(xì)胞活力得到恢復(fù)，因此后續(xù)試驗(yàn)確定L-精氨酸添加量為5 和10 μg/mL，處理時間為6 h。

GSH-Px和T-SOD是標(biāo)志性的抗氧化酶，在緩解氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用。GSH-Px功能和CAT相似，它可以以谷胱甘肽為底物清除過氧化氫，也可以清除脂質(zhì)過氧化物[10]。SOD是體內(nèi)清除自由基的主要物質(zhì)，可以維持體內(nèi)氧化-抗氧化平衡[11-12]。在本研究中，熱處理極顯著降低了MLTC-1細(xì)胞GSH-Px的活力，添加L-精氨酸后，熱處理MLTC-1細(xì)胞GSH-Px的活力增強(qiáng)，說明L-精氨酸可以提高熱處理MLTC-1細(xì)胞的抗氧化能力。

細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡。Bcl-2基因家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因，具有抗凋亡作用，可抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，還可通過細(xì)胞色素C下游的一個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，阻斷細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)[13-15]。Bax也可通過激活線粒體通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，通過促進(jìn)細(xì)胞色素C等小分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞漿，活化Caspase-3激活核酸內(nèi)切酶，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。PI3K家族成員參與多條信號通路[17]，對細(xì)胞的生長、分化和凋亡起著重要作用[18]。PI3K激活后在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使 PIP3，PIP3 與細(xì)胞內(nèi)信號蛋白AKT的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，磷酸化AKT蛋白的308位蘇氨酸，活化AKT蛋白[19]。活化后的AKT通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白[20]。在本研究中，熱處理誘導(dǎo)了MLTC-1細(xì)胞的凋亡，添加L-精氨酸后，凋亡細(xì)胞數(shù)下降，當(dāng)L-精氨酸添加量為5 μg/mL時，凋亡相關(guān)基因PI3K和Bcl-2的基因表達(dá)量顯著增加。這表明，L-精氨酸可通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，緩解熱處理誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

StAR是類固醇激素合成的限速酶，SF-1是類固醇生成因子1，在類固醇生成、腦和垂體激素調(diào)控、腎上腺腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，是腎上腺和性腺發(fā)育及功能的重要調(diào)控因子。3β-HSD(Hsd3b1)的表達(dá)具有細(xì)胞及組織特異性，睪丸組織內(nèi)只有間質(zhì)細(xì)胞才會表達(dá)。3β-HSD能通過改變孕烯醇酮C5、C6之間的雙鍵，將Δ5甾體轉(zhuǎn)變?yōu)棣?甾體[21]，是所有活性類固醇激素所必須的一種脫氫酶。17α-羥化酶(Cyp17a1)在睪酮合成中具有非常關(guān)鍵的催化作用[22-23]。在本研究中，添加5 μg/mLL-精氨酸顯著促進(jìn)了StAR、SF-1和Cyp17a1基因表達(dá)；添加10 μg/mLL-精氨酸時，StAR基因表達(dá)顯著上調(diào)，表明L-精氨酸可調(diào)控?zé)崽幚鞰LTC-1細(xì)胞類固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá)。

4 結(jié)論

適量的L-精氨酸可增強(qiáng)MLTC-1細(xì)胞的抗氧化及抗凋亡能力，緩解熱處理誘導(dǎo)的MLTC-1細(xì)胞凋亡，并且可調(diào)控?zé)崽幚鞰LTC-1細(xì)胞睪酮合成相關(guān)基因的表達(dá)。