陳同強(qiáng)，李 燦，郭錦材 *，向 俊，徐文泱，易守福，李凱龍

（1.食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410111；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；3.長(zhǎng)沙市口腔醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006；4.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

葡萄酒因營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而被人們所喜愛，其中含有豐富的氨基酸、果膠、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有鋅、硒等多種微量元素和植物源抗氧化劑[1-7]。在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，葡萄酒品質(zhì)參差不齊，導(dǎo)致價(jià)格也有高有低，所以很多葡萄酒愛好者更傾向于自己釀制。自釀葡萄酒的工藝相對(duì)比較簡(jiǎn)單，個(gè)人可以根據(jù)自身的喜好對(duì)口感（如酸甜度等）進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，自釀葡萄酒的一般制作方法：選葡萄-清洗-搗碎-裝罐-加酵母-加白糖-發(fā)酵-紗布過濾-勾兌與調(diào)配-貯存。

甲醇是飲料酒中的有害成分，是一種神經(jīng)性毒物，在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為甲酸、甲醛，甲醛的毒性更強(qiáng)，能引發(fā)視神經(jīng)萎縮，導(dǎo)致失明[8-10]。GB/T 15037—2006《葡萄酒》[11]對(duì)紅葡萄酒中甲醇限量有明確要求，含量≤400 mg/L；白、桃紅葡萄酒含量則要求≤250 mg/L。

一般正規(guī)的葡萄酒廠有健全的設(shè)備，也有相關(guān)的安全質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)甲醇的限量把關(guān)嚴(yán)格，很少出現(xiàn)安全事故。而大多數(shù)家庭自釀葡萄酒過程簡(jiǎn)單，也沒有除去甲醇的工藝，有時(shí)會(huì)發(fā)生因喝自釀葡萄酒中毒的新聞，其中最多的是酒中甲醇超標(biāo)引起的中毒事件，所以在自釀過程中如何有效地控制甲醇含量在安全范圍已成為亟需解決的問題。目前國(guó)內(nèi)外，對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量測(cè)定及影響葡萄酒口感工藝研究報(bào)道甚多[12-18]，而對(duì)其中甲醇含量控制研究鮮見。

本研究圍繞發(fā)酵容器、發(fā)酵溫度、陳釀時(shí)間等多個(gè)簡(jiǎn)單可行的環(huán)節(jié)來控制自釀葡萄酒中甲醇的產(chǎn)生，結(jié)合氣相色譜法檢測(cè)，在保證葡萄酒口感品質(zhì)前提下，通過優(yōu)化工藝條件以達(dá)到降低酒中甲醇含量的目的，從而為自釀族們提供科學(xué)的技術(shù)指導(dǎo)，從而達(dá)到為自釀葡萄酒質(zhì)量安全提供保障的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄：常見品種刺葡萄；甲醇（純度≥99%）、叔戊醇（內(nèi)標(biāo)）（純度≥99%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；酒曲（釀酒酵母＋米根霉）：湖南省永鑫酒曲有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；RTX-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：北京科益恒達(dá)科技有限公司。圓柱形塑料材質(zhì)發(fā)酵器、圓柱形橡木材質(zhì)發(fā)酵器、圓柱形陶瓷材質(zhì)發(fā)酵器、圓柱形玻璃材質(zhì)發(fā)酵器（4種發(fā)酵容器容積均在3 L左右，高度約為30 cm）。

1.3 方法

1.3.1 釀制工藝[19-21]

選取果面干凈帶粉的葡萄3份，每份1.0 kg，分別用涼開水輕輕沖洗之后鋪開晾干，將葡萄去柄捏破裝入發(fā)酵罐，按照1∶10比例加入白糖并攪拌均勻，添加一定量釀酒酵母。由于葡萄經(jīng)由酵母發(fā)酵，在此工程中會(huì)產(chǎn)生大量的二氧化碳?xì)怏w，如葡萄盛裝的過滿，就會(huì)導(dǎo)致葡萄酒從玻璃瓶中溢出，因此，發(fā)酵瓶罐不宜裝得過滿，需留出約1/3空間，最后蓋上瓶蓋在一定溫度條件下進(jìn)行發(fā)酵釀造。

以甲醇含量為依據(jù)，分別考察發(fā)酵容器（塑料發(fā)酵容器、木質(zhì)發(fā)酵容器、陶瓷發(fā)酵容器、玻璃發(fā)酵容器）、釀酒酵母添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、發(fā)酵溫度（環(huán)境）（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（10 d、15 d、20 d、25 d、30 d）、陳釀溫度（環(huán)境）（10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃）、陳釀時(shí)間（30 d、60 d、90 d、120 d、150 d）對(duì)葡萄酒中甲醇產(chǎn)生的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、陳釀時(shí)間（C）為自變量，以甲醇含量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 自釀葡萄酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation technology optimization of home-brewed wine

1.3.4 測(cè)定方法

甲醇含量：參考GB 5009.266—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測(cè)定》進(jìn)行檢測(cè)[22]。

他是作家中的“勞動(dòng)模范”，筆耕不輟、著作等身；他是2016年“國(guó)際安徒生獎(jiǎng)”獲獎(jiǎng)?wù)?，也是首位獲此殊榮的中國(guó)作家；他一直堅(jiān)持用詩意的語言，抒寫道義、審美與悲憫，引領(lǐng)孩子們歷練成長(zhǎng)……走近著名兒童文學(xué)作家曹文軒。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同發(fā)酵容器材質(zhì)對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響

由圖1可知，選擇采用木質(zhì)發(fā)酵容器酒中甲醇含量最低，可能與木材對(duì)甲醇有一定吸附作用有關(guān)，而采用塑料作為發(fā)酵容器，酒中甲醇含量最高，已超過標(biāo)準(zhǔn)限量規(guī)定（400 mg/L）。塑料材質(zhì)中可能存在一定量的有機(jī)溶劑殘留（如甲醇等），微生物發(fā)酵過程釋放熱量，會(huì)加速塑料中甲醇的釋放，從而導(dǎo)致甲醇含量超標(biāo)。因此，選擇木質(zhì)發(fā)酵容器對(duì)甲醇含量控制效果要比其他3類要更合適。

圖1 不同發(fā)酵容器材質(zhì)對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響Fig.1 Effect of different fermentation containers on methanol contents of home-brewed wine

2.1.2 釀酒酵母添加量對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響

由圖2可知，隨著酵母添加量的增加，自釀葡萄酒中的甲醇含量呈先降低后升高的趨勢(shì)，釀酒酵母添加量為1.0%時(shí)，得到的葡萄酒中甲醇含量最低，含量為298 mg/L。當(dāng)釀酒酵母添加過少時(shí)，葡萄酒發(fā)酵過程較緩慢，這會(huì)容易引起雜菌的生長(zhǎng)，發(fā)酵所產(chǎn)生的甲醇含量雖不高，但會(huì)導(dǎo)致葡萄酒的果香和酒香香氣淡薄，風(fēng)味也不夠協(xié)調(diào)；而當(dāng)釀酒酵母添加過大時(shí)，甲醇含量也變化較小，這是由于酵母菌為了生存而競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致酵母菌的發(fā)酵受到抑制，酒精產(chǎn)生量少，雜菌加速繁殖，酸味與苦澀味變得更加突出，葡萄酒的果香和酒香香味變得淡薄。故最佳酵母菌接種量為1.0%左右。由于在整個(gè)發(fā)酵工藝優(yōu)化過程中酵母添加量對(duì)葡萄酒中甲醇含量的影響較其他因素而言并不明顯，故而酵母添加量在響應(yīng)面試驗(yàn)中不作為考察對(duì)象。

圖2 釀酒酵母添加量對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響Fig.2 Effect of Saccharomyces cerevisiae addition on methanol contents of home-brewed wine

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，自釀葡萄酒中的甲醇含量呈先降低后升高的趨勢(shì)，在發(fā)酵溫度25 ℃時(shí)，甲醇含量最低，為288 mg/L。因此，選擇自釀葡萄酒發(fā)酵溫度為25 ℃比較合適。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on methanol contents of home-brewed wine

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，自釀葡萄酒中的甲醇含量呈先降低后升高的趨勢(shì)，在發(fā)酵時(shí)間為20 d時(shí)，甲醇含量最低，為285 mg/L。因此，選擇自釀葡萄酒發(fā)酵時(shí)間為20 d比較合適。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on methanol contents of home-brewed wine

2.1.5 陳釀溫度對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響

由圖5可知，在陳釀溫度為20 ℃時(shí)，葡萄酒中甲醇含量最低，為292 mg/L。而陳釀溫度過高卻會(huì)影響到葡萄酒口感及風(fēng)味，因此，選擇自釀葡萄酒陳釀溫度為20 ℃比較合適。由于在整個(gè)工藝優(yōu)化過程中陳釀溫度對(duì)葡萄酒中甲醇含量的影響較其他因素而言并不明顯，故而陳釀溫度在響應(yīng)面試驗(yàn)中不作為考察對(duì)象。

圖5 陳釀溫度對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響Fig.5 Effect of aging temperature on methanol contents of home-brewed wine

2.1.6 陳釀時(shí)間對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響

自釀葡萄酒發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)倒灌過濾后得到濾液，經(jīng)過一定時(shí)間陳釀，不僅加速了酒中雜醇類物質(zhì)的分解，而且提升了葡萄酒的口感，特別是經(jīng)過橡木桶陳釀之后，葡萄酒的色澤不但有所改善，而且減少了酒的青澀味，增強(qiáng)了酒體結(jié)構(gòu)。同時(shí)，通過一定時(shí)間陳釀，自釀葡萄酒中甲醇含量會(huì)有所降低，由圖6可知，隨著陳釀時(shí)間延長(zhǎng)，葡萄酒中甲醇含量逐漸減小，陳釀90 d時(shí)，自釀葡萄酒中甲醇含量為250 mg/L，繼續(xù)延長(zhǎng)陳釀時(shí)間，甲醇含量變化不大；此時(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的400 mg/L，因此，選擇自釀葡萄酒陳釀時(shí)間為90 d比較合適。

圖6 陳釀時(shí)間對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量的影響Fig.6 Effect of aging time on methanol contents of home-brewed wine

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化葡萄酒工藝試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 數(shù)字模型的建立及分析

結(jié)合單因素試驗(yàn)所獲結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化自釀葡萄酒工藝條件。選取發(fā)酵溫度（A），發(fā)酵時(shí)間（B），陳釀時(shí)間（C）3個(gè)因素作為影響因子，以甲醇含量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由Design Expert 8.0.6軟件統(tǒng)計(jì)計(jì)算，對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到各因素水平對(duì)自釀葡萄酒中甲醇含量影響的二次多項(xiàng)回歸模型：Y=283.20+9.25A+0.13B+2.13C-2.50AB-6.00AC-1.75BC+29.22A2+4.98B2+4.22C2。

表2 自釀葡萄酒發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization of home-brewed wine

由表3 可知，上述建立的回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.504 3＞0.05）。表明自釀葡萄酒工藝數(shù)據(jù)模型的選取具有一定的科學(xué)性與合理性；模型的決定系數(shù)R2為0.967 9，校正決定系數(shù)R2Adj為0.926 7，則表明該模型與試驗(yàn)的結(jié)果擬合度良好，因此可用此模型對(duì)基于甲醇含量控制的自釀葡萄酒工藝參數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。根據(jù)表3中F值大小可以判斷，3個(gè)因素對(duì)自釀葡萄酒中甲醇含量的影響大小順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞陳釀時(shí)間＞發(fā)酵時(shí)間，其中一次項(xiàng)A達(dá)極顯著水平（P＜0.01），交互項(xiàng)AC達(dá)顯著水平（P＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2對(duì)自釀葡萄酒中甲醇含量的影響也達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。綜合所有數(shù)據(jù)結(jié)果表明，該模型能較好地反映出自釀葡萄酒工藝中發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、陳釀時(shí)間3者之間的關(guān)系，所得的回歸方程能較好地預(yù)測(cè)自釀葡萄酒工藝中甲醇含量在不同條件下的變化規(guī)律。

表3 以甲醇含量為響應(yīng)值回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model based on methanol content as response value

2.2.2 影響因子間交互作用分析

通過采用Design-Expert.V 8.0.6軟件繪制自釀葡萄酒工藝的響應(yīng)面圖與等高線圖，可以較直觀地反映出各因素及其相互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。響應(yīng)面圖的曲面彎曲程度越大，則表明兩因素間的交互作用越顯著。

由圖7可直觀地反映出自釀葡萄酒工藝中的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、陳釀時(shí)間之間的交互作用對(duì)其中甲醇含量的影響程度。發(fā)酵溫度和陳釀時(shí)間的交互作用對(duì)自釀葡萄酒中甲醇含量的影響顯著（P＜0.05），其余因素間交互作用影響不顯著（P＞0.05），這與方差分析結(jié)果一致。

圖7 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、陳釀時(shí)間交互作用對(duì)甲醇含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature,time and aging time on methanol content

2.3 針對(duì)自釀葡萄酒工藝的驗(yàn)證

通過軟件分析所建立的發(fā)酵工藝模型，得到自釀葡萄酒最佳工藝條件為發(fā)酵溫度24.04 ℃，發(fā)酵時(shí)間19.16 d，陳釀時(shí)間為80.97 d。為便于實(shí)際操作及工藝條件的可行性，將最佳工藝參數(shù)修正為發(fā)酵溫度24 ℃，發(fā)酵時(shí)間19 d，陳釀時(shí)間為81 d。在此工藝條件下進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，計(jì)算得到甲醇含量實(shí)際值為281 mg/L，與預(yù)測(cè)值279 mg/L相近，說明本試驗(yàn)的回歸模型方程具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳條件所得自釀葡萄酒，檢測(cè)得到其各項(xiàng)指標(biāo)為：酒精度（溫度為20 ℃時(shí)）為13.5%vol；總糖為58.7 g/L；干浸出物為29.8 g/L；揮發(fā)酸（以乙酸計(jì)）為0.6 g/L；檸檬酸為0.9 g/L。產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15037—2006《葡萄酒》要求。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)自釀葡萄酒甲醇含量影響較大的3個(gè)因素，對(duì)釀造工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。最終確定自釀葡萄酒工藝的最優(yōu)參數(shù)為選擇木質(zhì)發(fā)酵容器發(fā)酵，酒曲添加量1.0%，發(fā)酵溫度24 ℃，發(fā)酵時(shí)間19 d，陳釀溫度20 ℃，陳釀時(shí)間81 d，在此工藝條件下制得的葡萄酒呈現(xiàn)紫紅色，清亮透明，無顯見懸浮物，具有和諧純正的果香味，口感較純正、舒暢及完整，回味悠長(zhǎng)，具備葡萄酒的良好風(fēng)格，甲醇含量為281 mg/L。因此，本研究得出的最優(yōu)控制甲醇含量的葡萄酒釀造工藝具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，對(duì)提高自釀葡萄酒質(zhì)量安全有重要的實(shí)際意義。