曾禮蘭，劉嬡春，方 帥，孫 群，胡 承*

（四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065）

中國(guó)白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一。它通常由玉米、大米、小麥、豌豆、小米和高粱等谷物為原料，通過(guò)酒曲發(fā)酵，經(jīng)蒸煮、糖化、蒸餾、貯存、勾兌而成[1]。許多研究表明，適度飲酒有助于身體健康[2-3]，但過(guò)量飲酒也會(huì)導(dǎo)致多種疾病[4-5]。世界衛(wèi)生組織報(bào)告稱，每年有300萬(wàn)人因?yàn)E用酒精而死亡[6]。白酒濫飲造成的傷亡和損失，通常被歸咎于酒中的乙醇[7]。然而，白酒中除乙醇和水（約占98%～99%），還有小部分溶于酒中的醇類、酯類、酸類以及醛酮類等有機(jī)物（約占1%～2%），雖然這些風(fēng)味化合物的濃度很低，但其種類、組成及比例決定著白酒的口感、風(fēng)味[8-9]。PENEDA J等[10]指出，在相同的乙醇濃度下，酒精飲料比純乙醇對(duì)人體肝臟組織造成的損害更大，因?yàn)橐掖技捌渫滴镏g的相互作用增強(qiáng)了肝臟的氧化特性。此外，格絨澤仁等[11]通過(guò)對(duì)6款不同的濃香型白酒小鼠灌胃后的行為進(jìn)行研究后，推斷正丙醇和異戊醇是飲用濃香型白酒后導(dǎo)致行為障礙的關(guān)鍵高級(jí)醇。

乙醇代謝涉及兩個(gè)過(guò)程：乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）將乙醇氧化成乙醛，然后乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）將乙醛氧化成乙酸[12]。由于乙醇、乙醛的積累會(huì)損害機(jī)體[13]，為增加乙醇脫氫酶或乙醛脫氫酶活性，提高人體乙醇代謝，許多研究人員正在研究某些天然化合物或非酒精飲料[14-16]。同時(shí)，白酒風(fēng)味化合物對(duì)乙醇代謝的影響也逐漸引發(fā)關(guān)注。本研究以濃香型白酒為研究對(duì)象，通過(guò)氣相色譜分析和體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)，以白酒中風(fēng)味化合物的香氣活力值為基礎(chǔ)，探討了4種不同濃香型白酒中的10種醇、酯類物質(zhì)對(duì)ADH和ALDH活性的影響，為白酒風(fēng)味化合物對(duì)乙醇代謝的影響提供了新的信息和研究模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型白酒（SC1：68%vol、SC2：48%vol、SC3：38%vol）：四川某酒廠；濃香型白酒（JS：40.8%vol）：江蘇某酒廠；正丙醇、正戊醇、正丁醇、異戊醇、異丁醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯和己酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：天津精細(xì)化工研究所；乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙醇、乙醛（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；焦磷酸鈉、乙二胺四乙酸、吡唑、氫氧化鈉、巰基乙醇（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7900II型氣相色譜儀：浙江福立分析儀器股份有限公司；（30 m×0.32 mm×1 μm）白酒專用色譜柱：四川知本分析科技有限公司；SQPPRACTUM224-1CN電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；N4紫外可見(jiàn)光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；PHS-2C筆式pH計(jì)：上海康儀儀器有限公司；DK-8D恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；JB-2恒溫磁力攪拌器：上海雷磁新涇儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 濃香型白酒的氣相色譜分析

內(nèi)標(biāo)的制備：以60%vol乙醇溶液為基體溶液，分別配制體積分?jǐn)?shù)2%的叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)溶液。

樣品的制備：吸取10.00 mL白酒樣品到比色管中，分別添加8.00 μL內(nèi)標(biāo)（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸）溶液，充分混勻。

色譜條件：福立7900II型氣相色譜儀上配有白酒專用色譜柱（30 m×0.32 mm×1 μm），檢測(cè)器溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，柱流量為1.00 mL/min，分流比為1∶50。柱溫為程序性升溫，升溫條件：烘箱溫度最初為45 ℃，維持6 min，然后以6 ℃/min升溫至65 ℃，維持7 min，再以15 ℃/min升溫至200 ℃，維持6 min，最后以15 ℃/min升溫至210 ℃，維持10 min。

4種濃香型白酒均按照以上條件及方法進(jìn)行氣相色譜分析，獲得4種白酒中風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析

定性分析：叔戊醇作內(nèi)標(biāo)用于醇類的分析；乙酸正戊酯作內(nèi)標(biāo)用于酯類及醛酮類組分的分析；2-乙基丁酸作內(nèi)標(biāo)用于乙酸后流出的高沸點(diǎn)組分及乳酸乙酯的分析。根據(jù)各組分與標(biāo)樣的保留時(shí)間作為定性的主要因素。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。香氣活力值=風(fēng)味物質(zhì)的含量/風(fēng)味物質(zhì)的閾值。

1.3.3 體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)

酒樣預(yù)處理：將10種風(fēng)味化合物單體分別添加到4種濃香型白酒中，充分振蕩搖勻，風(fēng)味化合物的添加量為1%（V/V），根據(jù)國(guó)家對(duì)血液酒精含量（blood alcohol concentration，BAC）的相關(guān)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)前將添加風(fēng)味化合物的白酒稀釋至酒精度為0.1%vol。

乙醇脫氫酶活性的測(cè)定：將1.7 mL 0.1 mol/L焦磷酸鹽緩沖液（pH 8.8），0.1 mL 1.25 U/mL乙醇脫氫酶和0.1 mL樣品在30 ℃條件下混合，并加入1.0 mL 5 mmol/L NAD+啟動(dòng)反應(yīng)。為了繪制曲線，在15 min內(nèi)，測(cè)定反應(yīng)體系OD340nm值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將無(wú)乙醇時(shí)的吸光度值設(shè)定為空白。

乙醛脫氫酶活性的測(cè)定：30 ℃條件下將1.4 mL 0.1 mol/L焦磷酸緩沖液（pH 9.0）、0.1 mL 0.8 U/mL乙醛脫氫酶、0.1 mL 0.1 mol/L乙醛、0.1 mL 0.01 mol/L吡唑、0.1 mL 3 mol/L氯化鉀、0.1 mL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸、0.05 mL 1 mol/L 2-巰基乙醇和0.1 mL樣品混合，加入1.0 mL 3.6 mmol/L NAD+引發(fā)反應(yīng)。最后，在15 min內(nèi)，測(cè)量反應(yīng)體系OD340nm值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按照下式計(jì)算酶活性抑制率：

式中：OD實(shí)驗(yàn)組為濃香型白酒中加入某種風(fēng)味物質(zhì)單體后的體系吸光度值；OD對(duì)照組為濃香型白酒的體系吸光度值；OD空白組為無(wú)乙醇時(shí)的體系吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酒樣風(fēng)味化合物香氣活力值分析

不同白酒的獨(dú)特香味的形成離不開酒中酯類、醇類、酸類以及其他的香味物質(zhì)的作用，通過(guò)香氣活力值（odor activityvalue，OAV），可以比較各香味物質(zhì)的呈香能力，OAV值大則表明該物質(zhì)對(duì)酒的呈香貢獻(xiàn)較大，反之則說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)酒的呈香貢獻(xiàn)相對(duì)較小，從而評(píng)估各風(fēng)味化合物對(duì)酒的風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)程度[17]。根據(jù)氣相色譜法對(duì)4種濃香型白酒的定性、定量分析，結(jié)果如表1所示。

表1 氣相色譜分析4種濃香型白酒中風(fēng)味化合物的含量及種類Table 1 Contents and kinds of flavor compounds in four varieties of strong-flavor Baijiu by gas chromatography

續(xù)表

由表1可知，4種酒樣共檢測(cè)出醇類9種，酯類9種，酸類7種，醛、酮及雜環(huán)類5種，其中酒樣SC3的風(fēng)味化合物種類、總酯含量以及高級(jí)醇含量都低于其他3種酒樣，酒樣SC1中總酯含量和高級(jí)醇含量最高。

對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的OAV值進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，酯類物質(zhì)的OAV值普遍高于酸類物質(zhì)的OAV值和醇類物質(zhì)的OAV值，其中己酸乙酯的含量和OAV值都最高，OAV＞7 000。此外，戊酸乙酯和丁酸乙酯的OAV值也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他風(fēng)味物質(zhì)，在4種酒樣中均在800以上；酸類物質(zhì)中己酸的OAV值較高；醇類物質(zhì)中OAV值較高的是正丁醇，過(guò)量的雜醇油是酒中苦味的主要來(lái)源，其中正丁醇極苦[21]。

表2 4種濃香型白酒中風(fēng)味物質(zhì)的香氣活力值Table 2 Odor activity value of flavor compounds in four varieties of strong-flavor Baijiu

由氣相色譜分析和OAV值可知，酯類物質(zhì)在4種濃香型白酒中具有較高含量和OAV值，這表明，酯類化合物對(duì)這4種酒的香味形成有重要貢獻(xiàn)，是酒中關(guān)鍵的香氣成分組成。而己酸可以通過(guò)酯化作用形成濃香型白酒的主體香己酸乙酯[22]；其次，醇類物質(zhì)是酒中的助香物質(zhì)，具有襯托酯香的作用，但酒中醇類含量過(guò)高，不僅會(huì)影響口感，還會(huì)導(dǎo)致酒后頭疼，出現(xiàn)飲后“上頭”現(xiàn)象[23]。因此，鑒于以上原因，研究主要以4種濃香型白酒中香氣貢獻(xiàn)較大的酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)為研究對(duì)象。

2.2 體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)分析

酯類和醇類是白酒中必不可少的風(fēng)味物質(zhì)，但酒中過(guò)量的酯類和醇類不利于人體健康。為了減少醇類物質(zhì)帶來(lái)的不利，許多降解酒中醇類的方法被陸續(xù)報(bào)道出來(lái)，如HAN Q等[24]從蘋果皮中提取了能降解酒中醇類物質(zhì)的酶。然而，關(guān)于降低酯類物質(zhì)的報(bào)道較少。作為自然釀造及固態(tài)蒸餾得到的白酒，這些微量成分的存在及其相對(duì)比例對(duì)酒固有風(fēng)味的貢獻(xiàn)是不可缺少的。

本研究以常規(guī)的濃香型白酒作為對(duì)照，通過(guò)體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)初步測(cè)定了濃香型白酒中的代表性酯類和醇類物質(zhì)對(duì)ADH和ALDH活性的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，向白酒中加入風(fēng)味化合物后，除乳酸乙酯以外，所有風(fēng)味化合物均抑制ADH的活性，且它們?cè)诓煌陌拙浦杏胁煌囊种坡省４蠖鄶?shù)風(fēng)味化合物的抑制率在20%以下，而SC1中正戊醇（27.64%）、異丁醇（29.32%）和戊酸乙酯（26.72%）的抑制率遠(yuǎn)高于其他化合物；與對(duì)ADH活性的影響不同，除正丙醇外（抑制率＞7%），向白酒中添加醇類和酯類物質(zhì)可提高ALDH的活性（抑制率＜0%），且不同風(fēng)味化合物抑制率的差異與白酒的種類無(wú)關(guān)。在這些化合物中，正丁醇和乙酸乙酯對(duì)ALDH活性的抑制率相似，約為-8%～-10%。研究中的大多數(shù)風(fēng)味化合物，尤其是JS中的異丁醇，都提高了ALDH活性。然而，由于底物濃度效應(yīng)，其活性仍然受到抑制，乙醇的代謝速率依然很低。醇類物質(zhì)抑制乙醇代謝關(guān)鍵酶的活性，降低乙醇的氧化速率，并且自身的氧化程度低于乙醇[25]，這可以部分解釋為什么醇類物質(zhì)含量不合理是酒后“上頭”的原因。

圖1 4種濃香型白酒中醇類、酯類對(duì)乙醇脫氫酶活性和乙醛脫氫酶活性的影響Fig.1 Effects of alcohols and esters in four strong-flavor Baijiu on alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase activities

由于SC1中正戊醇、異丁醇和戊酸乙酯的抑制率遠(yuǎn)高于其他化合物，且SC1中正戊醇和戊酸乙酯的濃度高于其他3個(gè)濃香型白酒品種，探究了SC1中不同濃度的正戊醇、異丁醇和戊酸乙酯對(duì)ADH活性的影響，如圖2a所示，并進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果如圖2b～圖2d所示，它們對(duì)ADH活性的抑制具有劑量依賴性的（相關(guān)系數(shù)R2均＞0.9）。

圖2 不同濃度的風(fēng)味化合物（a）、正戊醇（b）、異丁醇（c）和戊酸乙酯（d）對(duì)乙醇脫氫酶抑制率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of flavor compounds (a),1-pentanol (b),isobutanol (c) and ethyl pentanoate (d) on inhibition rate of alcohol dehydrogenase

綜上可初步判斷，研究中的風(fēng)味化合物對(duì)ADH和ALDH活性的影響可分為三類：（1）絕大部分風(fēng)味化合物抑制ADH活性，促進(jìn)ALDH活性；（2）同時(shí)抑制ADH和ALDH活性，如正丙醇，它導(dǎo)致乙醇代謝受阻，乙醇大量積累；（3）輕度抑制或促進(jìn)ADH活性，強(qiáng)烈促進(jìn)ALDH活性，如乳酸乙酯，它將有利于提高飲后舒適度，以及降低乙醇、乙醛積累造成的患病風(fēng)險(xiǎn)。為了研究這些化合物對(duì)ADH活性影響和對(duì)ALDH活性影響之間的關(guān)系，進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，這些化合物對(duì)ADH活性影響和對(duì)ALDH活性影響之間的相關(guān)性非常弱（相關(guān)系數(shù)R2＜0.15），這表明抑制（或促進(jìn)）ADH活性的化合物不同于抑制（或促進(jìn)）ALDH活性的化合物，尤其是在JS中（相關(guān)系數(shù)R2=0.054 7）。

圖3 4個(gè)濃香型白酒中醇、酯類物質(zhì)對(duì)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶抑制率影響的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of effects of alcohols and esters on the inhibition rates of ethanol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase in four varieties of strong-flavor Baijiu

3 結(jié)論

本研究結(jié)合氣相色譜、香氣活力值以及體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)4種濃香型白酒的風(fēng)味化合物進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，酯類化合物是濃香型白酒中的關(guān)鍵香氣成分，對(duì)濃香型白酒的風(fēng)味形成有重要貢獻(xiàn)，尤其是己酸乙酯（OAV≥7 284）、戊酸乙酯（OAV≥1 276）、丁酸乙酯（OAV≥845）；其次，多種酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)對(duì)ADH活性和ALDH活性的影響差異很大，對(duì)于ADH活性，除乳酸乙酯外，醇酯類物質(zhì)通常抑制ADH活性，其中正戊醇、異丁醇和戊酸乙酯的抑制率最高，分別為27.64%、29.32%和26.72%，而對(duì)于ALDH活性，除正丙醇外，醇酯類物質(zhì)會(huì)不同程度地促進(jìn)ALDH活性。以上研究初步闡釋了酒類風(fēng)味物質(zhì)對(duì)乙醇代謝關(guān)鍵酶作用效應(yīng)，對(duì)于白酒酒體的設(shè)計(jì)與開發(fā)工作將有所啟發(fā)。