程洋洋，惠靖茹，郝競(jìng)霄，黃占旺*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

香菇（Lentinus edodes）屬于真菌門擔(dān)子菌亞門傘菌目口蘑科香菇屬[1]，在食用菌種植上是全球第二大品種[2]。肉質(zhì)肥厚細(xì)嫩、香氣濃郁、營(yíng)養(yǎng)豐富而廣受人們喜愛(ài)，是一種藥食同源的食物，具有抗氧化、預(yù)防種瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血脂、抗血栓、健脾保肝、預(yù)防佝僂病及貧血等功效，是我國(guó)久負(fù)盛名的食用菌[3]。但在日常生活和加工生產(chǎn)過(guò)程中，常將香菇柄丟棄，造成資源上的巨大浪費(fèi)。香菇柄約占香菇總質(zhì)量的25%～30%，因其含有大量的膳食纖維，直接食用不僅難以咀嚼，并且不利于消化吸收，但將香菇柄進(jìn)行發(fā)酵后制作成醬糕，不僅保留了營(yíng)養(yǎng)成分還賦予了其特殊的風(fēng)味物質(zhì)[10-11]。

香菇柄發(fā)酵醬糕是以黃豆、糯米、香菇柄粉為原料制成的香菇醬，經(jīng)過(guò)添加其他的食品原料制成的一種糕點(diǎn)，不但營(yíng)養(yǎng)豐富而且風(fēng)味獨(dú)特，含有蛋白質(zhì)、多肽、維生素等對(duì)人體有益的生理活性物質(zhì)，具有一定的保健功能。

本試驗(yàn)以糯米、黃豆為原料，米曲霉為發(fā)酵菌種進(jìn)行香菇柄發(fā)酵醬糕的制曲，以蛋白酶活力、淀粉酶活力、纖維素酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)[12]，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)挑選出制曲的最優(yōu)條件，旨在為生產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)異的香菇柄發(fā)酵醬糕提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆：贛州康瑞農(nóng)產(chǎn)品有限公司；米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.042：濟(jì)寧玉園生物科技有限公司；糯米：市售；可溶性淀粉：西隴化工股份有限公司；福林酚、干酪素、3,5二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：北京索萊寶科技有限公司；羧甲基纖維素鈉：上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MHP-250型霉菌培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器、LDZM立式壓力蒸汽滅菌器、GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；JH2102電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制曲工藝

黃豆與糯米按照一定的比例混合，浸泡12 h后撈出瀝干水分，在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min，取出后攤開(kāi)放置于桌面自然冷卻至30 ℃以下，接種一定比例的米曲霉As3.042，隨后放入霉菌培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)至制曲結(jié)束，在此期間翻曲1次，防止米曲霉As3.042在曲料上生長(zhǎng)不均勻影響成曲品質(zhì)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

設(shè)定糯米黃豆質(zhì)量比分別為1∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4，米曲霉接種量分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%[13]，培養(yǎng)時(shí)間分別為12h、24h、36h、48h、60h，培養(yǎng)溫度分別為22℃、26℃、30 ℃、34 ℃、38 ℃。原料混勻后浸泡12 h撈出瀝干水分，在121 ℃高壓滅菌鍋中蒸煮15 min，取出冷卻至30 ℃以下，接入0.7%的米曲霉As3.042，霉菌培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)48 h后取出，在40 ℃的烘箱內(nèi)烘干后粉碎測(cè)定酶活力，分別考察原料質(zhì)量比、接種量、培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)溫度對(duì)制曲的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)選出的條件，對(duì)米曲霉接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，利用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，并對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，確定最佳制曲工藝條件，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.4 試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定

蛋白酶活力測(cè)定參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定》福林酚法相關(guān)步驟，只進(jìn)行了中性蛋白酶酶活的測(cè)定[14]；水分含量的測(cè)定按照國(guó)標(biāo)GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》中常壓干燥法測(cè)定[15]；淀粉酶活力測(cè)定采用DNS比色法進(jìn)行測(cè)定[16]；纖維素酶活力的測(cè)定采用羧甲基纖維素鈉法[17]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化分析、SPSS 26.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析、Origin 8.5進(jìn)行繪圖處理。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 原料質(zhì)量比對(duì)成曲酶活力的影響

由圖1可知，當(dāng)糯米與黃豆的質(zhì)量比為2∶3時(shí)，成曲中蛋白酶活力達(dá)到峰值為2 535.05 U/g，此時(shí)淀粉酶活力與纖維素酶活力已經(jīng)由峰值開(kāi)始減小，但因這兩種酶對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)影響較小。因此，選用糯米與黃豆的質(zhì)量比為2∶3時(shí)制曲。

圖1 不同原料質(zhì)量比對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effect of different material mass ratios on enzyme activities

2.1.2 接種量對(duì)成曲酶活力的影響

由圖2可知，隨著米曲霉接種量的不斷增加，三種酶活力均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。接種量為0.5%時(shí)，纖維素酶活力達(dá)到最大值為67.35 U/g，此時(shí)蛋白酶活力、淀粉酶活力還未達(dá)到峰值；當(dāng)接種量為0.7%時(shí)，蛋白酶活力、淀粉酶活力最大為2 536.46 U/g和245.13 U/g。隨著接種量的繼續(xù)增加，酶活力都出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，這是由于接種量過(guò)大時(shí)，米曲霉所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足自身的生長(zhǎng)需要，進(jìn)而影響后續(xù)的酶活力大小。因此，在進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)選取米曲霉接種量為0.5%、0.7%、1.0%。

圖2 不同米曲霉接種量對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effect of different inoculum of Aspergillus oryzae on enzyme activity

2.1.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)成曲酶活力的影響

由圖3可知，培養(yǎng)時(shí)間在12～60 h之間時(shí)，蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶活力都隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增大后減小的規(guī)律，3種酶活都在培養(yǎng)時(shí)間在48 h達(dá)到峰值。當(dāng)生長(zhǎng)條件適宜的情況下，米曲霉生長(zhǎng)旺盛，三種酶活力增強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，原料中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，菌絲體因缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸開(kāi)始衰退，代謝產(chǎn)物減少，三種酶活力達(dá)到最大值后便開(kāi)始有所下降。因此，選用44 h、48 h、52 h設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.3 Effect of different culture time on enzyme activity

2.1.4 培養(yǎng)溫度對(duì)成曲酶活力的影響

當(dāng)培養(yǎng)箱的溫度設(shè)置的過(guò)低時(shí)，酶雖然不會(huì)失活，但溫度對(duì)酶的鈍化作用使米曲霉的生長(zhǎng)與新陳代謝活動(dòng)減弱，從而酶活力變?nèi)?。過(guò)高的溫度對(duì)米曲霉生長(zhǎng)與產(chǎn)酶的影響更大，甚至?xí)苯訉?dǎo)致酶的失活[18]。由圖4可知，培養(yǎng)溫度在26～34 ℃區(qū)間時(shí)，三種酶活力都出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在溫度為30 ℃時(shí)三種酶活力均達(dá)到最大值分別為2 365.10 U/g、403.51 U/g、46.25 U/g。因此，選擇26 ℃、30 ℃、34 ℃用于后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effect of different culture temperature on enzyme activity

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnben試驗(yàn)的原理，固定糯米與黃豆質(zhì)量比為2∶3，選取米曲霉接種量（A）、培養(yǎng)時(shí)間（B）、培養(yǎng)溫度（C）為試驗(yàn)因素，以蛋白酶活力（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

由于米曲霉接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度對(duì)蛋白酶活的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，因此對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行了多元回歸分析，明確了米曲霉接種量（A）、培養(yǎng)時(shí)間（B）、培養(yǎng)溫度（C）三個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值蛋白酶活力（Y）的影響情況，分析后得到的回歸方程為：

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for fermentation conditions optimization

2.2.2 模型方差分析

通過(guò)軟件Design-Expert 8.0.6對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，以驗(yàn)證回歸模型與因素的顯著性，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，二次多項(xiàng)式回歸模型P＜0.000 1，決定系數(shù)R2=98.89%＞85%，說(shuō)明該回歸模型極顯著、擬合程度很好，試驗(yàn)誤差小，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)香菇柄發(fā)酵醬糕的制曲試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。失擬項(xiàng)P=0.1108＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著。根據(jù)F值可知，3個(gè)因素對(duì)成曲蛋白酶活力的影響大小從大到小依次為：培養(yǎng)溫度（C）、米曲霉接種量（A）、培養(yǎng)時(shí)間（B）。一次項(xiàng)A對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），一次項(xiàng)C對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)酶活的影響均不顯著（P＞0.05），但二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)酶活的影響極顯著（P＜0.01）。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2.3 響應(yīng)面分析

米曲霉接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度的交互效應(yīng)及等高線見(jiàn)圖5。響應(yīng)面越陡則說(shuō)明該試驗(yàn)中的某個(gè)因素對(duì)蛋白酶活力的影響越大，等高線越近似于一個(gè)橢圓形，那么就表示這兩個(gè)因素的交互作用越強(qiáng)[19]。由圖5a可知，隨著米曲霉接種量和培養(yǎng)時(shí)間的增加，蛋白酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，且其等高線圖偏圓形，判斷米曲霉接種量和培養(yǎng)時(shí)間之間的交互作用不顯著；由圖5b可知，隨著米曲霉接種量和培養(yǎng)溫度的提高，蛋白酶活力呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明米曲霉接種量和培養(yǎng)溫度之間存在一定的相互影響作用，但它們的交互作用不顯著；由圖5c可知，等高線偏橢圓形，表明兩個(gè)因素之間有一定的交互作用但不顯著，這與回歸方程方差分析的結(jié)果是一致的[20]。對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)一步分析篩選，計(jì)算得到香菇柄發(fā)酵醬糕的最優(yōu)制曲工藝條件為米曲霉接種量0.78%、培養(yǎng)時(shí)間48.02 h、培養(yǎng)溫度30.85 ℃，此條件下蛋白酶活力預(yù)測(cè)值為2 592.67 U/g。

圖5 各因素交互作用對(duì)蛋白酶活力影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of each factor on protease activity

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)所需條件和實(shí)際的可操作性，調(diào)整修正后的香菇柄發(fā)酵醬糕制曲條件為：米曲霉接種量0.8%、培養(yǎng)時(shí)間48 h、培養(yǎng)溫度30 ℃。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，對(duì)制曲試驗(yàn)結(jié)果取平均值，得到香菇柄發(fā)酵醬糕成曲的蛋白酶活力實(shí)際值為2 625.48 U/g，同模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為1.27%（＜5%），說(shuō)明響應(yīng)面法對(duì)香菇柄發(fā)酵醬糕制曲的工藝條件優(yōu)化具有實(shí)際可行性，可為后續(xù)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)[21]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先依據(jù)蛋白酶活力、淀粉酶活力、纖維素酶活力的大小，采用單因素試驗(yàn)確定了各個(gè)因素的最優(yōu)范圍，然后采用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)制曲的條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得品質(zhì)符合要求的成曲。優(yōu)化后得到香菇柄發(fā)酵醬糕的最佳制曲工藝為：在糯米和黃豆質(zhì)量比2∶3、米曲霉接種量0.8%、培養(yǎng)時(shí)間48 h、培養(yǎng)溫度30 ℃，所得到的成曲蛋白酶活力為2 625.48 U/g，該成曲表面布滿黃綠色孢子，菌絲體生長(zhǎng)良好，有明顯的曲香味，無(wú)雜菌生長(zhǎng)和其他異味。