董 玲，李 露，郭云建，趙 馳，羅 靜，朱鵬程，楊 永，朱永清，李治華*

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；2.郫都區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村和林業(yè)局，四川 成都 611730；3.大竹鵬程果業(yè)農(nóng)民專(zhuān)業(yè)合作社，四川 大竹 635100）

水果具有生產(chǎn)上市時(shí)間較為集中，貨架期短、不耐貯存的特點(diǎn)，極易出現(xiàn)旺季滯銷(xiāo)的問(wèn)題[1]。果醋屬于水果精深加工產(chǎn)品[2]，選擇適宜品種進(jìn)行果醋加工是解決水果滯銷(xiāo)的一個(gè)有效途徑。果醋既具有傳統(tǒng)醋的酸味物質(zhì)，又具有水果的果香味和營(yíng)養(yǎng)成分，被譽(yù)為第四代飲料[3]。傳統(tǒng)的果醋發(fā)酵主要分為兩個(gè)階段，第一個(gè)階段是利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）將水果汁中的糖分發(fā)酵成酒精，第二個(gè)階段是利用醋酸菌將酒精轉(zhuǎn)化成醋酸。采用這種發(fā)酵方式生產(chǎn)的果醋存在酸味單一、口感刺激的問(wèn)題。添加乳酸菌發(fā)酵是改善果醋風(fēng)味的一個(gè)途徑，果醋中不揮發(fā)酸的主要成分是乳酸，乳酸與其他成分一起能賦予果醋圓潤(rùn)和棉柔的風(fēng)味[4]。醋醅中有豐富的乳酸菌菌種資源，高產(chǎn)酸乳酸菌在食醋釀造過(guò)程中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。許女等[5]從山西老陳醋發(fā)酵過(guò)程中分離篩選得到1株高產(chǎn)酸、高產(chǎn)乙偶姻的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和1株發(fā)酵揮發(fā)性成分含量豐富的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），并將其應(yīng)用于山西老陳醋發(fā)酵，大幅度提升了山西老陳醋總酸、不揮發(fā)性酸和總酯的含量；余永建[6]從鎮(zhèn)江香醋醋醅中分離得到一株瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），并將其應(yīng)用于食醋強(qiáng)化發(fā)酵，能有效縮短醋酸發(fā)酵周期、提高乳酸相對(duì)含量、改善食醋口感。然而目前關(guān)于從果醋醋醅分離高產(chǎn)酸乳酸菌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用MRS培養(yǎng)基從桃果醋醋醅中分離具有強(qiáng)產(chǎn)酸能力的乳酸菌，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并研究其乙醇耐受能力、產(chǎn)酸能力和抗生素敏感性，從而篩選出具有改善果醋風(fēng)味品質(zhì)的乳酸菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃果醋醋醅：大竹鵬程果業(yè)農(nóng)民專(zhuān)業(yè)合作社；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乙醇（分析純）、濃硫酸（分析純）、瓊脂粉（生化試劑）：成都市科龍化工試劑廠；DL-蘋(píng)果酸、D-酒石酸、琥珀酸、富馬酸、草酸、檸檬酸、乙酸、L-乳酸、奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；抗生素紙片：杭州微生物試劑有限公司；土壤基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速抽提試劑盒、2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）、引物1492R（5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'）：生工生物工程（上海）股份有限公司；BHI乳酸菌生化鑒定條：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPX-87H液相分析柱：美國(guó)伯樂(lè)公司；AC2-6S1二級(jí)生物安全柜：新加坡Esco公司；CP153分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫科技公司；FlexCycle PCR儀：德國(guó)耶拿分析儀器有限公司；SUP-250生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HBM-400拍擊式均質(zhì)器：天津恒奧科技發(fā)展有限公司；5810R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；Synergy HTX多功能微孔板檢測(cè)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌株的分離純化

稱取10 g桃果醋醋醅到100 mL無(wú)菌生理鹽水中，用拍擊式均質(zhì)器拍打混勻，取1 mL均質(zhì)液到9 mL無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0-6、10-7、10-8倍稀釋液100 μL到含1%CaCO3的MRS固體平板，涂布，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取具有最大溶鈣圈的菌落接種到含1%CaCO3的MRS固體平板反復(fù)劃線純化獲得純菌株。

1.3.2 分離菌株的鑒定

形態(tài)觀察：將分離菌株接種到MRS固體平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)和顯微形態(tài)。

生理生化試驗(yàn)：將分離菌株劃線接種到MRS固體平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h長(zhǎng)出單菌落，隨機(jī)挑取2個(gè)平板上的單菌落分別用生理鹽水制成菌懸液，根據(jù)說(shuō)明書(shū)接種到BHI乳酸菌生化鑒定條，37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

分子生物學(xué)鑒定：將分離菌株D2接種到MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL菌液12 000×g離心5 min后，棄上清，取菌體沉淀用作DNA提取，具體操作按照土壤基因組DNA快速抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以提取的基因組DNA為模板對(duì)分離菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：DNA 1 μL，PCR引物27F（10 μmol/L）和1492R（10 μmol/L）各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL、雙蒸水（ddH2O）22 μL；PCR擴(kuò)增程序參照王志山等[7]的方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)搜索[8]，選取與分離菌株同源性較高的10株模式菌株的16S rDNA基因序列，利用MEGA 6.06軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[9]。

1.3.3 分離菌株對(duì)乙醇的耐受性

將分離菌株接種到30 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。分別取以上培養(yǎng)液600 μL接種到30 mL含0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%（V/V）乙醇的MRS肉湯培養(yǎng)基中，接種3個(gè)平行，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，取200 μL培養(yǎng)液到96孔板，用Synergy HTX多功能微孔板檢測(cè)儀測(cè)定OD600nm值。

1.3.4 分離菌株的產(chǎn)酸能力

取300 μL分離菌株培養(yǎng)液接種到30 mL MRS液體培養(yǎng)基，接種3個(gè)平行，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，將培養(yǎng)液12 000×g離心10 min，取上清液測(cè)定總酸和有機(jī)酸組成?？偹岷浚ㄒ匀樗嵊?jì)）測(cè)定：參照文獻(xiàn)[10]采用滴定法測(cè)定。有機(jī)酸含量測(cè)定：以MRS肉湯培養(yǎng)基為空白，參照文獻(xiàn)[11]采用高效液相色譜法測(cè)定。

1.3.5 分離菌株對(duì)抗生素的敏感性

將100 μL分離菌株培養(yǎng)液涂布到MRS固體平板，將抗生素紙片放在MRS固體平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，每種抗生素紙片做3個(gè)平行，觀察抑菌圈情況[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株的分離純化

通過(guò)MRS固體培養(yǎng)基從桃果醋醋醅中分離純化得到一株溶鈣圈最大的菌株，編號(hào)為D2，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No：1.16283

2.2 菌株D2的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察結(jié)果

菌株D2在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h的菌落及細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株D2的菌落突起、表面光滑、邊緣整齊、乳白色、不透明，菌落大小為1～2 mm，與胡博等[14]鑒定的鼠李糖乳桿（Lactobacillus rhamnosus）菌菌落形態(tài)一致。用革蘭氏染色液染色后，在油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，其為短桿狀、單個(gè)或線性排列，這與COLLINS M D等[15]報(bào)道的鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的細(xì)胞形態(tài)一致。

圖1 菌株D2的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colonial (a) and cell (b) morphology of strain D2

2.2.2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

挑取1個(gè)單菌落到2 mL無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，采用海博生物HBI乳酸菌生化鑒定條進(jìn)行生理生化鑒定，發(fā)酵七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、菊糖和乳糖均為陽(yáng)性，發(fā)酵棉籽糖為陰性，與鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（JCM1136）[16-17]糖發(fā)酵能力一致。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株D2的16S rDNA基因序列堿基長(zhǎng)度為1 491 bp，其序列與鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）JCM 1136相似性最高，相似性為98.21%，其次與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）ATCC 393相似性為97.31%。選取與菌株D2 16S rDNA基因序列相似性最高的10株模式菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株D2與鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）JCM 1136聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定菌株D2為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）。鼠李糖乳桿菌已被列為《可用于食品的菌種名單》，是公知的無(wú)毒、無(wú)副作用的益生菌，可用于食品發(fā)酵。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株D2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain D2 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株D2對(duì)乙醇的耐受性試驗(yàn)結(jié)果

菌株D2在含不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的MRS肉湯培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖3。

圖3 菌株D2的乙醇耐受性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of ethanol tolerance tests of strain D2

由圖3可知，菌株D2在所有接種的培養(yǎng)基中都有生長(zhǎng)，且在含體積分?jǐn)?shù)0～4%乙醇的MRS肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能力基本一致，OD600nm值明顯比體積分?jǐn)?shù)6%～14%乙醇的高，說(shuō)明0～4%乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株D2生長(zhǎng)沒(méi)有表現(xiàn)出抑制現(xiàn)象。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%～14%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，菌株D2的OD600nm值逐漸減少，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，對(duì)菌株D2的生長(zhǎng)抑制性越強(qiáng)。金丹等[18]研究了12株乳酸菌的乙醇耐受能力，僅有3株菌在乙醇體積分?jǐn)?shù)14%下還能存活，存活率≤2%，其中有一株存活率為2%的菌株為鼠李糖乳桿菌；劉威良等[19]研究了10株不同乳酸菌菌種的乙醇耐受能力，其中嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）相比其他7株乳酸菌具有更強(qiáng)的乙醇耐受能力；本研究中菌株D2在乙醇含量14%下還具有一定的生長(zhǎng)能力，且菌株D2也為鼠李糖乳桿菌，推測(cè)鼠李糖乳桿菌類(lèi)可能帶有乙醇耐受基因。

2.4 菌株D2產(chǎn)酸能力分析結(jié)果

菌株D2發(fā)酵液中的總酸含量見(jiàn)圖4。

圖4 菌株D2發(fā)酵液中的總酸含量Fig.4 Total acid content in fermentation broth of strain D2

由圖4可知，菌株D2發(fā)酵24 h時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量為16.4 g/L，發(fā)酵48 h時(shí)總酸含量為20.03 g/L，發(fā)酵72 h時(shí)總酸含量為19.97 g/L，表明發(fā)酵48 h時(shí)，發(fā)酵液中總酸含量基本趨于穩(wěn)定。采用高效液相色譜儀檢測(cè)發(fā)酵48 h的發(fā)酵液中草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、奎寧酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、富馬酸等有機(jī)酸含量，具體結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，發(fā)酵液中乳酸含量最高，為（17.45±0.06）g/L，其次是乙酸（4.06±0.04）g/L和檸檬酸（1.35±0.07）g/L，乳酸含量增加最多，其次是蘋(píng)果酸和琥珀酸。檸檬酸含量低于MRS肉湯培養(yǎng)基，酒石酸、奎寧酸和富馬酸未檢出?？赡苁怯捎谌樗峋趨捬鯒l件下將丙酮酸代謝成乙酸和H+，H+將延胡索酸還原成琥珀酸，導(dǎo)致發(fā)酵液中乙酸和琥珀酸含量增加[20]。草酸、琥珀酸和蘋(píng)果酸是三羧酸循環(huán)途徑的中間代謝物，其在發(fā)酵過(guò)程中不會(huì)積累太多[21]。菌株D2發(fā)酵液中總酸含量為20.03 g/L，陳卓等[22]從四川麩醋醋醅中分離到的鼠李糖乳桿菌總酸含量?jī)H為1.97 g/L。

表1 菌株D2 48 h發(fā)酵液中有機(jī)酸檢測(cè)結(jié)果Table 1 Determination results of organic acids in fermentation broth of strain D2 at 48 h g/L

2.5 菌株D2對(duì)抗生素的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

菌株D2對(duì)抗生素的敏感試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和圖5。由表2及圖5可知，菌株D2對(duì)四環(huán)素、酰胺醇類(lèi)（氯霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（紅霉素、吉他霉素）敏感，對(duì)氨基糖苷類(lèi)（鏈霉素、卡那霉素）、青霉素類(lèi)（青霉素、苯唑西林）和黃胺類(lèi)（復(fù)方新諾明）具有抗性。菌株D2對(duì)氨基糖苷類(lèi)敏感這一試驗(yàn)結(jié)果與NAWAZ M等[23]的研究結(jié)果一致，乳酸菌類(lèi)對(duì)鏈霉素和卡那霉素具有抗性。菌株D2對(duì)四環(huán)素具有抗性，而SHARMA P等[24]研究了9株鼠李糖乳桿菌的抗生素敏感性，其中僅有一株對(duì)四環(huán)素具有抗性，說(shuō)明菌株對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的敏感性存在個(gè)體差異。

表2 菌株D2抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of antibiotic susceptibility tests of strain D2

圖5 菌株D2抗生素敏感效果Fig.5 Effect of antibiotic susceptibility of strain D2

3 結(jié)論

通過(guò)MRS固體培養(yǎng)基從桃果醋醋醅中分離到1株具有強(qiáng)產(chǎn)酸能力的乳酸菌，編號(hào)為D2，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）。該菌株在體積分?jǐn)?shù)4%乙醇下能夠正常生長(zhǎng)，在體積分?jǐn)?shù)14%乙醇下能夠存活，具有較強(qiáng)乙醇耐受力；在MRS肉湯培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h時(shí)，總酸含量達(dá)到20.03 g/L，其中乳酸含量增加最多，其次是蘋(píng)果酸和琥珀酸；對(duì)四環(huán)素、酰胺醇類(lèi)（氯霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（紅霉素、吉他霉素）敏感，對(duì)氨基糖苷類(lèi)（鏈霉素、卡那霉素）、青霉素類(lèi)（青霉素、苯唑西林）和黃胺類(lèi)（復(fù)方新諾明）具有耐藥性。該菌株具有較強(qiáng)的乙醇耐受能力和產(chǎn)乳酸能力，安全性高，有一定的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。