胡 悅，李漢文，喻 晨，余華順，姚 鵑，龔大春*

（1.三峽大學 生物與制藥學院，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443002；3.中國輕工業(yè)功能酵母重點實驗室，湖北 宜昌 443002）

堿性蛋白酶是一類在堿性條件下能將多肽鏈水解為氨基酸的酶，其最適pH值一般在9～11左右，最早發(fā)現(xiàn)于豬的胰臟中，屬于絲氨酸蛋白酶，其活性中心含有絲氨酸，分子質量在26 000～34 000 Da[1-2]。堿性蛋白酶作為一種重要的蛋白水解酶，可廣泛應用于洗滌劑行業(yè)、食品加工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、皮革制造行業(yè)、絲綢制造行業(yè)、環(huán)保行業(yè)等[3-6]。據(jù)報道蛋白酶占全球酶制劑銷售總量的60%～65%，其中堿性蛋白酶用量最大[7]。

堿性蛋白酶生產(chǎn)以微生物發(fā)酵法為主，目前國內堿性蛋白酶的生產(chǎn)效率并不高，產(chǎn)品供不應求，導致部分產(chǎn)品仍依賴進口[8]。因此，堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株的缺乏已成為堿性蛋白酶生產(chǎn)的技術瓶頸之一。常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種是近年來興起的一種誘變技術，具有射流溫度低，產(chǎn)生的等離子體均勻，對人體安全，操作簡便，成本低，與生物大分子和細胞作用明顯等優(yōu)點[9-11]。目前在對霉菌、細菌、酵母誘變改造方面均取得較好的效果，但利用ARTP誘變技術選育高產(chǎn)堿性蛋白酶鮮見報道[12]。物理化學復合誘變方式具有協(xié)同效應，比單一誘變效果更好。氯化鋰（LiCl）作為化學助誘變劑，可進一步提高高產(chǎn)菌株的篩選幾率。邱雁臨等[13]利用紫外線-氯化鋰復合誘變選育L-組氨酸產(chǎn)生菌，所得高產(chǎn)菌株產(chǎn)L-組氨酸含量比原始菌株提高13.6%，比單一紫外誘變后的菌提高5.1%；李兆飛等[14]利用氯化鋰-離子束復合誘變選育高產(chǎn)核酸酶P1菌株，所得高產(chǎn)菌株酶活較原始菌株提高45.8%，比單一離子束誘變后的誘變株產(chǎn)酶量提升20.4%。

本研究以地衣芽孢桿菌（Bacillus chlamydiae）為出發(fā)菌株，利用常壓室溫等離子體（ARTP）結合氯化鋰進行物理化學復合誘變。其優(yōu)勢在于在保證安全性的前提下，提升誘變強度，更有利于篩選出高產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株，同時以單因素和響應面試驗對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期用于提升工業(yè)生產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）E-417：安琪酵母股份有限公司菌種保藏室。

1.1.2 試劑

牛肉膏、瓊脂粉、蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；磷酸氫二鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；玉米粉：濮陽縣英倫玉米加工有限公司；豆餅粉：安陽天祥瑞食品科技有限公司；碳酸鈉、氯化鈉：北京西隴化工有限公司；酵母粉、葡萄糖：安琪酵母股份有限公司；酪蛋白：阿法埃莎（中國）化學有限公司。實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基[15]：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

酪蛋白鑒別平板培養(yǎng)基[16]：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，酪蛋白10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基[17]：牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[18]：玉米粉35 g/L，豆餅粉25 g/L，磷酸氫二鈉2 g/L，碳酸鈉1.25 g/L。按配方要求準確稱取豆餅粉及玉米粉原料，加水充分溶解后加入高溫淀粉酶（20 U/g玉米粉），同時邊攪拌邊升溫至90～95 ℃液化30 min，最后加入其他原料，攪拌均勻，調pH值至7.2，121 ℃滅菌40 min備用。

1.2 儀器與設備

ARTP-M常溫常壓等離子體誘變儀：無錫源清天木生物科技有限公司；GHP9080隔水恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；HHS4水浴鍋：江蘇金怡儀器科技有限公司；TDL-608離心機：上海安亭科學儀器廠；SP-754紫外分光光度計：上海光譜儀器有限公司；ZWYR-211D恒溫搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將地衣孢桿菌E-417甘油管接種至種子培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h。待菌落鋪滿整個茄瓶后，倒入100 mL無菌水，用無菌接種鏟將菌泥洗出混勻，即得菌懸液。

1.3.2 氯化鋰誘變

參考文獻[19]的方法。在菌懸液中加入1.5%的氯化鋰，于180 r/min、37 ℃條件下進行誘變處理10 min后待用。

1.3.3 氯化鋰-ARTP復合誘變

參考文獻[20]的方法。將ARTP設備開啟預熱，調節(jié)照射功率為120 W，照射距離為2 mm，氦氣（He）流量為10 L/min，開啟操作室紫外燈滅菌20 min。取10 μL菌液至無菌金屬載片上，涂抹均勻。將載片放入誘變室內，對菌液誘變處理0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s、105 s。將處理好的金屬載片放入無菌離心管中，加1 mL無菌水稀釋至10-3，振搖3 min，再進一步稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7，取100 μL菌液至酪蛋白鑒別平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)20～24 h，以處理0 s為對照組，計算致死率及正突變率，其計算公式如下：

1.3.4 高產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的篩選

初篩：酪蛋白是蛋白酶系的作用底物，將誘變菌液涂布至酪蛋白鑒別平板上會出現(xiàn)明顯的水解圈，測量水解圈直徑與菌落直徑，并計算其比值（HC值），篩選出HC值較大的單菌落為高產(chǎn)堿性蛋白酶誘變株[21]。

復篩：用無菌接種鏟刮取初篩得到的誘變株接種至種子培養(yǎng)基，于37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)12 h后，按10%（V/V）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)48 h，離心取上清液，測定酶活。

1.3.5 堿性蛋白酶酶活的測定

取2 mL發(fā)酵液在12 000 r/min條件下離心5 min，保留上清液，用硼酸緩沖液（pH 10.5）稀釋至合適倍數(shù)，按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》規(guī)定的福林（Folin）法測定酶活力[22]。

堿性蛋白酶酶活力單位定義：在40 ℃條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即為1個酶活力單位（U/mL）。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性研究

將復篩得到的正突變菌株連續(xù)傳代至8代，分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)48 h，離心取上清液，測定酶活，考察高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性[23]。

1.3.7 誘變株發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶條件優(yōu)化

單因素試驗：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件基礎上，采用單因素輪換法依次考察不同碳源（葡萄糖、玉米淀粉、玉米粉）、氮源（酵母粉、豆餅粉、豆粕粉）、玉米粉添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、豆餅粉添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、磷酸氫二鈉添加量（1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L）、碳酸鈉添加量（1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L）、初始pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、接種量（4%、6%、8%、10%、12%）、發(fā)酵溫度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）對堿性蛋白酶活力的影響，確定發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件。

響應面試驗：在單因素試驗基礎上，選取3個對酶活影響較大的因素，進行3水平3因素的Box-Behnken響應面試驗設計[24]，以玉米粉（A）、豆餅粉（B）、碳酸鈉（C）添加量為自變量，以堿性蛋白酶酶活（Y）為響應值進行進一步優(yōu)化。采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)結果進行分析，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 氯化鋰-ARTP復合誘變結果

氯化鋰是一種堿金屬鹵化劑，為助誘變劑，與ARTP進行復合誘變，更有利于正突變菌株的產(chǎn)生。采用1.5%氯化鋰處理10 min后，進行ARTP誘變，將誘變時間設定在0～105 s范圍內，不同誘變時間下，地衣芽孢桿菌E-417的致死率及正突變率見圖1。

圖1 不同LiCl-ARTP復合誘變時間下地衣芽孢桿菌E-417的致死率及正突變率Fig.1 Fatality rate and positive mutation rate of Bacillus licheniformis E-417 by LiCl-ARTP compound mutation with different mutation time

由圖1可知，菌株致死率隨ARTP照射時間而增加，正突變率呈先上升后下降趨勢。當誘變時間為45 s時，菌株致死率達到94.6%，正突變率為14.7%，達到最高。當誘變時間為60 s時，菌株致死率達到95.3%，正突變率驟降至8.5%。當誘變時間為75 s時，該菌株致死率已達到100%。因此氯化鋰-ARTP復合誘變最佳條件為氯化鋰添加量1.5%，ARTP照射45 s。

2.2 高產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的篩選

將誘變后的菌液涂布至酪蛋白鑒定平板，地衣芽孢桿菌分泌的堿性蛋白酶可將酪蛋白分解為小分子氨基酸，致使菌落周圍形成水解圈（見圖2）[25]。經(jīng)過多次的復合誘變試驗，初篩得到132株HC值（3.51～4.32）較大的單菌落，再經(jīng)搖瓶復篩測定酶活，最終篩選出16株發(fā)酵酶活明顯高于原始菌株的誘變株，結果見表2。

圖2 酪蛋白平板篩選結果Fig.2 Results of casein plate screening

由表2可知，HC值的大小在一定程度上反映了菌株產(chǎn)堿性蛋白酶的能力，HC值越大，酶活越高。16株誘變菌株中，誘變株F-3與F-8的HC值及堿性蛋白酶酶活最高，故對這兩株誘變株進行遺傳穩(wěn)定性驗證。

表2 復合誘變后高產(chǎn)堿性蛋白酶誘變菌株的篩選結果Table 2 Screening results of high yield alkaline protease mutant strain after compound mutation

2.3 遺傳穩(wěn)定性驗證

為了檢驗誘變株F-3、F-8的遺傳穩(wěn)定性，對突變株F-3、F-8進行連續(xù)傳代8次，并同時進行發(fā)酵培養(yǎng)，采用福林（Folin）法對每代菌株的發(fā)酵上清液進行酶活測定，結果見表3。

由表3可知，經(jīng)過8次連續(xù)傳代，2株誘變菌株均具有良好遺傳穩(wěn)定性，其中誘變株F-3的酶活最高，達到12 870 U/mL，較原始菌株提高了39.5%，因此，選用此菌株進行后續(xù)研究。

表3 傳代8次后誘變株F-3和F-8的遺傳穩(wěn)定性Table 3 Genetic stability of mutant strains F-3 and F-8 after 8 passages

2.4 誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.4.1 不同碳源及氮源對誘變株F-3產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，以玉米粉為碳源時，誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶酶活最高為12 030 U/mL，明顯高于以葡萄糖、玉米淀粉為碳源的酶活，因而選擇玉米粉作為最優(yōu)碳源；以豆餅粉作為氮源時，誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶酶活最高為13000U/mL，明顯高于以豆粕粉、酵母粉為氮源的酶活，可能是由于豆餅粉粒度更細，更易被菌體代謝利用，經(jīng)蛋白酶水解后產(chǎn)生出更多的氨基酸，進一步誘導誘變株F-3產(chǎn)酶。因而選用豆餅粉作為最優(yōu)氮源。

圖3 不同碳源及氮源對誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶的影響Fig.3 Effect of different carbon and nitrogen sources on alkaline protease production by mutant strain F-3

2.4.2 玉米粉和豆餅粉添加量對誘變株F-3產(chǎn)酶的影響

由圖4可知，隨著玉米粉和豆餅粉添加量的不斷增大，堿性蛋白酶酶活均呈先上升后下降的趨勢，當玉米粉和豆餅粉添加量為40 g/L時，酶活均達到最高，分別為13 536 U/mL、14 870 U/mL，因此，選擇最優(yōu)玉米粉和豆餅粉添加量均為40 g/L。

圖4 玉米粉（a）和豆餅粉（b）添加量對誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶的影響Fig.4 Effect of corn flour (a) and soybean cake powder (b) additions on alkaline protease production by mutant strain F-3

2.4.3 磷酸氫二鈉及碳酸鈉添加量對誘變株F-3產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，隨著磷酸氫二鈉和碳酸鈉添加量的不斷增大，堿性蛋白酶酶活均呈先上升后下降的趨勢，當磷酸氫二鈉和碳酸鈉的添加量為2.0 g/L時，酶活均達到最高，分別為13 890 U/mL、15 567 U/mL。因此，選擇最優(yōu)磷酸氫二鈉和碳酸鈉添加量均為2.0 g/L。

圖5 不同金屬鹽添加量對誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶的影響Fig.5 Effect of different metal salts additions on alkaline protease production by mutant strain F-3

2.4.4 初始pH值對誘變株F-3產(chǎn)酶的影響

由圖6可知，誘變株F-3對初始pH值的變化較為敏感，隨著pH值的增加，堿性蛋白酶酶活呈先上升后下降的趨勢。pH值過低，菌體生長緩慢，影響產(chǎn)酶；pH值過高發(fā)酵后期菌體老化過快，從而影響其代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。當pH值為7.0時，發(fā)酵酶活最高為13 490 U/mL，因此，選擇最優(yōu)初始pH值為7.0。

圖6 初始pH值對誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶的影響Fig.6 Effect of initial pH on alkaline protease production by mutant strain F-3

2.4.5 接種量對誘變株F-3產(chǎn)酶的影響

由圖7可知，接種量對誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶影響較大，當接種量為4%時，由于接種量太少，菌體前期生長緩慢，產(chǎn)酶效率低；隨著接種量的逐步提高，產(chǎn)酶量逐漸增加。當接種量為8%時，堿性蛋白酶酶活最高為13 212 U/mL。隨著接種量的繼續(xù)提高酶活反而下降，可能是由于接種量過大，菌體生長過快，菌體提前消耗完底物培養(yǎng)基，產(chǎn)生了大量代謝副產(chǎn)物，影響了誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶的能力，因此，選擇最優(yōu)接種量為8%。

圖7 接種量對誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶的影響Fig.7 Effect of inoculum on alkaline protease production by mutantstrain F-3

2.4.6 發(fā)酵溫度對誘變株F-3產(chǎn)酶的影響

由圖8可知，隨著發(fā)酵溫度的提高，菌株產(chǎn)堿性蛋白酶活力呈先上升后下降的趨勢。當發(fā)酵溫度為31 ℃時，發(fā)酵溫度過低，菌體生長緩慢，產(chǎn)物合成能力降低，發(fā)酵酶活最低；當發(fā)酵溫度為37 ℃時，酶活最高為15 501 U/mL；當發(fā)酵溫度高于37℃，菌體生長過快，底料培養(yǎng)基過早耗竭，菌體提前衰亡，酶活開始下降。因此，選擇最優(yōu)發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖8 發(fā)酵溫度對誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on alkaline protease production by mutant strain F-3

2.5 誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗

2.5.1 響應面試驗設計與結果

根據(jù)單因素試驗的結果，以玉米粉（A）、碳酸鈉（B）、豆餅粉（C）添加量為自變量，以堿性蛋白酶酶活（Y）為響應值進行響應面試驗優(yōu)化，試驗設計及結果見表4。

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 Design and results of response surface tests

2.5.2 構建數(shù)學模型及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表4試驗數(shù)據(jù)進行分析，構建數(shù)學模型。得到最終二次回歸方程為：

回歸方程決定系數(shù)R2=0.996 6，表示有99.68%的數(shù)據(jù)可以用該模型來解釋，調整決定系數(shù)R2Adj=0.990 9，說明該方程擬合性較好，可以用于分析。

對回歸方程進行方差分析，結果見表5。由表5可知，模型的P＜0.000 1，表示此模型極顯著，失擬項的P=0.062 3＞0.05，說明失擬項不顯著，說明模型與試驗值之間的誤差較小。一次項A、B及二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項AB對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

表5 響應面試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface tests results

續(xù)表

2.5.3 響應面圖分析

各因素交互作用對誘變株F-3發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶影響的響應面及等高線見圖9。由圖9可知，當3個因素中其中一個固定為零水平時，其他兩個因素存在交互作用且存在一個最高的組合點，其中，碳酸鈉和玉米粉交互作用較顯著，響應面曲線走勢較陡，有明顯的最高點和最優(yōu)水平，與方差分析結果一致。

圖9 各因素交互作用對誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶的響應面和等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on alkaline protease production by mustant strain F-3

2.5.4 響應面預測與驗證

對回歸方程求解產(chǎn)堿性蛋白酶酶活的極大值，得出培養(yǎng)基玉米粉、碳酸鈉、豆餅粉的添加量分別為41.34 g/L、2.07 g/L、39.78 g/L，預測的產(chǎn)堿性蛋白酶酶活最高可達16 153.5 U/mL。為方便實際應用，將培養(yǎng)基調整為玉米粉41g/L、碳酸鈉2.1g/L、豆餅粉40g/L。在此優(yōu)化條件下進行3組平行試驗，得出平均堿性蛋白酶酶活實際值為16 156 U/mL，與預測值基本吻合。說明本次試驗模型對地衣芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶具有一定指導意義。

3 結論

本研究以提高堿性蛋白酶酶活為目標，采用ARTP與氯化鋰復合誘變方法對地衣芽孢桿菌E-417進行誘變，確定氯化鋰添加量1.5%，ARTP照射45 s為最適復合誘變條件。對誘變后的菌株進行酪蛋白平板初篩、搖瓶復篩、遺傳穩(wěn)定性驗證，最終篩選出誘變株F-3為高產(chǎn)堿性蛋白酶的優(yōu)良菌株，酶活達到12 147 U/mL，較原始菌株提高了31.7%。通過單因素及響應面試驗對其發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的條件進行優(yōu)化。結果表明，誘變株F-3產(chǎn)堿性蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉41 g/L、豆餅粉40 g/L、碳酸鈉2.1 g/L、磷酸氫二鈉2.0 g/L；最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度37 ℃、初始pH值7.0、接種量為8%。在此優(yōu)化條件下，堿性蛋白酶酶活達到16 156 U/mL，為進一步提高堿性蛋白酶酶活奠定基礎。