章宇丹，溫雪瓶，李 麗*，劉 軍，劉雪嬌，馮潔雅

（四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005）

阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase，F(xiàn)AE）E.C.3.1.1.73又名肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶，可以水解阿魏酸酯、多糖阿魏酸酯和低聚糖阿魏酸酯，屬于羧酸酯水解酶的一個(gè)亞類(lèi)[1]。該酶能夠水解植物細(xì)胞壁中阿魏酸或相關(guān)肉桂酸與多糖如阿拉伯木聚糖、果膠之間的酯鍵，釋放出游離的阿魏酸或阿魏酸二聚體[2]，從而對(duì)植物細(xì)胞壁起到降解作用[3]。阿魏酸酯酶還可以與木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素內(nèi)酯酶等協(xié)同作用更加徹底的降解植物細(xì)胞壁[4]。由于FAE的作用功能使得其在食品、飼料、紡織、造紙、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、生物能源等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用[5-8]。

阿魏酸又名4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是一種存在于許多植物細(xì)胞壁中的一種重要的酚酸物質(zhì)，如高粱、蘆根、麥稈、麥麩、米糠、玉米皮、洋蔥皮、發(fā)酵茶等植物細(xì)胞壁中，具有抗氧化、抗血栓、抗輻射、抗血小板凝集、改善心腦血管健康、對(duì)老年人具有恢復(fù)和改善記憶等功能[9-13]。阿魏酸可作為特定保健用食品素材，也可作為有益于人體健康的益生元功能配料應(yīng)用于食品飲料和膳食補(bǔ)充劑[14-15]。酒中阿魏酸的產(chǎn)生可以是在制曲和發(fā)酵過(guò)程中被微生物釋放出來(lái)，也可以是在制曲和發(fā)酵過(guò)程中形成中間產(chǎn)物，再由微生物轉(zhuǎn)化成阿魏酸，阿魏酸酯酶可以打破植物細(xì)胞壁中的酯鍵，進(jìn)而釋放阿魏酸[16-20]。據(jù)目前研究表明釀酒原料中的阿魏酸釋放率很低，研究提高釀造過(guò)程中阿魏酸的釋放量是很有必要的[21]。

國(guó)外沒(méi)有固態(tài)發(fā)酵的釀制白酒方式，因此對(duì)白酒中阿魏酸的研究較少。國(guó)內(nèi)目前對(duì)阿魏酸的研究主要集中在飼料、紡織、造紙、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、生物能源等領(lǐng)域。隨著我國(guó)國(guó)民收入水平的提高，人們對(duì)生活質(zhì)量的要求也越來(lái)越高，在保障白酒安全生產(chǎn)的同時(shí)還要讓白酒有益于消費(fèi)者的健康，健康飲酒已經(jīng)成為中國(guó)白酒的新趨勢(shì)。利用科技力量，剖析傳統(tǒng)工藝白酒中的成分以及找尋天然植物中的健康成分。

本試驗(yàn)以前期從濃香型白酒釀造過(guò)程中篩選出的一株產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株考氏科薩克氏菌（Kosakonia cowanii）為研究對(duì)象，對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究該菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活性質(zhì)及在麩皮、糟醅和大曲中的發(fā)酵應(yīng)用。本研究旨在為之后研究提高白酒中的阿魏酸含量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和材料

考氏科薩克氏菌（Kosakonia cowanii）：本實(shí)驗(yàn)室保存；大曲、糟醅：瀘州某酒廠；麩皮：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

NaCl、瓊脂粉、（NH4）2SO4、MgSO4·7H2O、C6H8O7·H2O、甲醇、Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；二甲基甲酰胺、FeCl3（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；阿魏酸乙酯、阿魏酸甲酯（均為分析純）：阿拉丁控股集團(tuán)有限公司；醋酸（分析純）：賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH4）2SO41.3 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KH2PO40.37 g，CaCl2·2H2O 0.07 g，F(xiàn)eCl30.02 g，酵母粉1.0 g，5 mL阿魏酸乙酯溶液（含10%的二甲基甲酞胺，V/V），水1 L。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LS-28HD立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；TGL-16M離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SWCJ-1FD超凈工作臺(tái)：上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；HWS-260A恒溫恒濕培養(yǎng)箱：杭州綠博儀器有限公司；SPH-1102恒溫?fù)u床：上海世平試驗(yàn)設(shè)備有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1200型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備[22]

菌株Kosakonia cowanii以1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于180 r/min、32 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h，發(fā)酵完后取9 mL發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，保留上清液，即獲得粗酶液。

1.3.2 酶學(xué)特性的研究

（1）酶的最適溫度及穩(wěn)定性

取2 mL緩沖液（pH 6.0）于試管中，加入2 mL 1 mmol/L阿魏酸甲酯溶液，分別放置于溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃的水浴鍋中反應(yīng)5 min，再分別加入1 mL酶液，水浴20 min，沸水滅酶終止反應(yīng)，混勻后以對(duì)照組為空白（失活的酶液）測(cè)定波長(zhǎng)320 nm處的吸光度值，以酶活最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性[23]。

將粗酶液分別放置于溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃的水浴鍋中保溫50 min，每隔10 min檢測(cè)一次酶活性，統(tǒng)一在50 ℃水浴鍋中反應(yīng)。以各溫度的初始酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性。

（2）酶的最適pH及穩(wěn)定性

取2 mL緩沖液（pH 2.6、3.2、3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0）于試管中，加入2 mL 1 mmol/L阿魏酸甲酯溶液，置于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，再分別加入1 mL酶液，在50 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，沸水終止反應(yīng)，混勻后以對(duì)照組為空白（失活的酶液）測(cè)定波長(zhǎng)320 nm處的吸光度值，以酶活最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活性。配制不同pH（3.2、3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0）緩沖液，與粗酶液等量混合，在4 ℃冰箱中放置2 h，測(cè)定剩余酶活，以各pH值的初始酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.3.3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

菌株Kosakonia cowanii預(yù)先進(jìn)行活化，以接種量分別為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%接種到培養(yǎng)基中，裝液量分別為30 mL/250 mL、60 mL/250 mL、90 mL/250 mL、120 mL/250 mL、150 mL/250 mL，初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0，分別置于溫度為28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃的搖床中，180 r/min培養(yǎng)72 h，檢測(cè)酶活，考察不同接種量、裝液量、初始pH值、溫度對(duì)酶活的影響，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.3.4 分析檢測(cè)

（1）阿魏酸酯酶酶活檢測(cè)

檢測(cè)方法：取9 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取上清液，即獲得粗酶液。取2 mL阿魏酸甲酯溶液和2 mL檸檬酸緩沖液（pH 6.0）在溫度為50 ℃水浴鍋中水浴5 min，再加入1 mL粗酶液，反應(yīng)20 min，沸水滅酶終止反應(yīng)，以煮沸失活的酶液為空白，在波長(zhǎng)320 nm條件下測(cè)定溶液吸光度值。

阿魏酸酯酶酶活定義：1 mL酶液在50 ℃、pH 6.0條件下，每分鐘酯解阿魏酸甲酯，生成1 μmol阿魏酸所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

（2）阿魏酸檢測(cè)

檢測(cè)方法：在糟醅、大曲和麩皮三角瓶中加入體積分?jǐn)?shù)70%甲醇，所加體積分別為45 mL、55 mL、80 mL，放置于溫度為30 ℃、180 r/min的搖床中搖30 min，然后10 000 r/min離心10 min，獲得上清液，將上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC分析。并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程y=-8.633 3+53.960 4x（R2=0.999 95）計(jì)算阿魏酸含量[24]。

色譜條件：ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，柱溫25 ℃，流動(dòng)相為甲醇和5%醋酸（25∶75，V/V），流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL[25]。

1.3.5 菌株初步應(yīng)用探究

（1）麩皮發(fā)酵

麩皮與水的料液比為1∶1（g∶mL），將稱(chēng)好的麩皮放入盆中，加水拌勻，稱(chēng)取40 g裝入三角瓶中，共8瓶，滅菌。將菌株進(jìn)行活化，以3%的接種量接種到滅菌的麩皮中，放置于溫度為34 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行有氧發(fā)酵，每天檢測(cè)阿魏酸含量，空白組為不加菌的麩皮。設(shè)置3個(gè)平行。

（2）糟醅發(fā)酵

稱(chēng)取45 g糟醅加入已滅菌的三角瓶中，用保鮮膜封口，共15瓶，分為兩組，一組為實(shí)驗(yàn)組，共7瓶，一組為對(duì)照組，每組8瓶。將菌株進(jìn)行活化，以3%的接種量接種到實(shí)驗(yàn)組中，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都放置于溫度為34 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，每天檢測(cè)阿魏酸含量，對(duì)照組不加菌。設(shè)置3個(gè)平行。

（3）大曲發(fā)酵

稱(chēng)取35 g大曲加入已滅菌的三角瓶中，共15瓶，分為兩組，一組為實(shí)驗(yàn)組，共7瓶，一組為對(duì)照組，每組8瓶。將菌株進(jìn)行活化，以3%的接種量接種到實(shí)驗(yàn)組中，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都放置于溫度為34 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行有氧發(fā)酵，每天檢測(cè)阿魏酸含量，對(duì)照組不加菌。設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)注誤差表示，使用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異性顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.1.1 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖1可知，培養(yǎng)基裝液量對(duì)酶活是有影響的，當(dāng)裝液量為30～90 mL/250 mL時(shí)，隨著裝液量的增加而增加；裝液量達(dá)到90 mL/250 mL時(shí)，酶活最大，為28.27 U/L；當(dāng)裝液量＞90 mL/250 mL后酶活逐漸減小。因此，最適裝液量為90 mL/250 mL。

圖1 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of liquid medium volume on enzyme production

2.1.2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)于微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶都有一定的影響。不同的初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶是有影響的，該菌株在初始pH值為5.0～8.0范圍下均能產(chǎn)酶，在初始pH值為5.5時(shí)，酶活最大，約為27.34 U/L。隨著初始pH值的增大，酶活呈遞減趨勢(shì)。因此，最適初始pH值為5.5。

圖2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of medium initial pH value on enzyme production

2.1.3 接種量對(duì)于產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，不同的接種量對(duì)酶活是有影響的，隨著接種量在0.5%～4.0%范圍內(nèi)的提高，酶活隨之增高，當(dāng)接種量為4%，酶活最高，為27.12 U/L；當(dāng)接種量＞4%后，酶活減少。

圖3 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of inoculum on enzyme production

2.1.4 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖4可知，溫度的變化影響酶活的大小，隨著溫度在28～34 ℃范圍內(nèi)的升高，酶活呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)溫度為34 ℃時(shí)，酶活最高；當(dāng)溫度＞34 ℃后隨著溫度的升高，酶活呈遞減趨。

圖4 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme production

2.1.5 優(yōu)化后產(chǎn)酶情況

根據(jù)前面的研究，將菌株以4%接種量接種到培養(yǎng)基中，裝液量為90 mL/250 mL，初始pH為5.5，在溫度為34 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3 d，檢測(cè)酶活。結(jié)果表明，優(yōu)化后酶活為28.27 U/L，比優(yōu)化前提高了20.92%。

2.2 酶學(xué)特性的研究

2.2.1 酶最適溫度及熱穩(wěn)定性

阿魏酸酯酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性，最適pH值及pH穩(wěn)定性分別見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 阿魏酸酯酶的最適溫度（A）及熱穩(wěn)定性（B）Fig.5 Optimal temperature (A) and thermal stability (B) of ferulic acid esterase

由圖5A可知，當(dāng)溫度＜50 ℃時(shí)，酶活呈逐漸上升狀態(tài)，這是因?yàn)樵诖藴囟确秶鷥?nèi)，隨著溫度的升高，促進(jìn)了反應(yīng)速度；當(dāng)溫度為50 ℃，此時(shí)相對(duì)酶活最高為100%；當(dāng)溫度＞50 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶活呈下降狀態(tài)，這是因?yàn)檫^(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致酶蛋白開(kāi)始變形。因此，酶的最適溫度為50 ℃。

由圖5B可知，阿魏酸酯酶在30～40 ℃范圍內(nèi)時(shí)穩(wěn)定性很好，在溫度為50 ℃時(shí)表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，50 ℃保溫50 min后，酶活仍保留58.96%。但當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，阿魏酸酯酶穩(wěn)定性較差，保溫50 min后殘余酶活不到20%。

2.2.2 酶最適pH及pH穩(wěn)定性

由圖6A可知，pH值為5.6時(shí)相對(duì)酶活最高為100%，兩邊呈遞減狀態(tài)，這是因?yàn)閜H會(huì)改變底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，進(jìn)而影響酶和底物的結(jié)合，而且過(guò)高或過(guò)低的pH都會(huì)影響酶的穩(wěn)定性，從而使酶遭受不可逆的破壞。因此，酶的最適pH值為5.6。

圖6 阿魏酸酯酶的最適pH值（A）及pH穩(wěn)定性（B）Fig.6 Optimal pH value (A) and pH stability (B) of ferulic acid esterase

由圖6B可知，酶活在pH值為5.0～6.8范圍內(nèi)放置2 h，其酶活穩(wěn)定性較好，殘余酶活均在80%以上，pH值在3.2～3.8范圍內(nèi)，酶活穩(wěn)定性較差。

2.3 菌株Kosakonia cowanii初步應(yīng)用

2.3.1 麩皮發(fā)酵

由圖7可知，麩皮發(fā)酵提取液在1～7 d，麩皮發(fā)酵釋放阿魏酸的含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)?？瞻捉M的麩皮阿魏酸含量為13.374 μg/g，麩皮發(fā)酵至第7天時(shí)的阿魏酸含量為16.3 715 μg/g，比空白組的麩皮阿魏酸含量提高了22.42%，該菌株發(fā)酵麩皮產(chǎn)生的阿魏酸酯酶，能夠釋放麩皮中的阿魏酸，從而提高釋放的阿魏酸含量，說(shuō)明菌株發(fā)酵能夠提高麩皮中阿魏酸的釋放。

圖7 麩皮發(fā)酵對(duì)阿魏酸含量的影響Fig.7 Effect of bran fermentation on ferulic acid content

2.3.2 糟醅發(fā)酵

由圖8可知，第0天的糟醅發(fā)酵提取液中阿魏酸的含量為11.136 6 μg/g，接菌的糟醅發(fā)酵第一天的阿魏酸含量與發(fā)酵0 d的糟醅發(fā)酵提取液中的阿魏酸含量相比有所增加，第二天之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)榍捌谌瞧恐泻醒鯕?，菌株能夠生長(zhǎng)，產(chǎn)生的阿魏酸酯酶釋放了糟醅中的阿魏酸，沒(méi)有氧氣后，糟醅中的阿魏酸不再被釋放，又因?yàn)榘⑽核岜环纸猓园⑽核岬暮恐饾u減少。對(duì)照組中糟醅的阿魏酸被分解，含量逐漸減少，沒(méi)有上升的過(guò)程。說(shuō)明菌株在前期有氧條件下能起到釋放阿魏酸的作用的；氧氣消耗完后，菌株停止產(chǎn)酶，阿魏酸含量逐漸降低。

圖8 糟醅發(fā)酵對(duì)阿魏酸含量的影響Fig.8 Effect of distilled grains fermentation on ferulic acid content

2.3.3 大曲發(fā)酵

由圖9可知，第0天的大曲發(fā)酵提取液中阿魏酸的含量為4.054 8 μg/g，實(shí)驗(yàn)組中的阿魏酸含量呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。這是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)組中接種的菌株產(chǎn)生阿魏酸酯酶，釋放了大曲中的阿魏酸，所以阿魏酸含量呈遞增趨勢(shì)。對(duì)照組中阿魏酸含量呈現(xiàn)先遞減后遞增的趨勢(shì)，出現(xiàn)遞增的趨勢(shì)可能是因?yàn)榇笄斜旧砗锌梢援a(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株，使大曲中的阿魏酸被釋放出來(lái)，所以出現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。出現(xiàn)遞減的趨勢(shì)可能是因?yàn)榍捌诎⑽核岬姆纸馑俣却笥诎⑽核狨ッ羔尫虐⑽核岬乃俣龋猿霈F(xiàn)遞減的趨勢(shì)。但是對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組中的阿魏酸被釋放的含量較少，說(shuō)明添加菌株有利于釋放大曲中阿魏酸，且能夠增加釋放阿魏酸的速度。

圖9 大曲發(fā)酵對(duì)阿魏酸含量的影響Fig.9 Effect of Daqu fermentation on ferulic acid content

3 結(jié)論

通過(guò)單因素優(yōu)化培養(yǎng)條件為：裝液量90 mL/250 mL、培養(yǎng)基初始pH值為5.5、接種量4%、溫度34 ℃。在此優(yōu)化條件下，酶活最高，酶活比優(yōu)化前提高了20.92%。阿魏酸酯酶最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在30～40 ℃時(shí)穩(wěn)定性良好；阿魏酸酯酶最適反應(yīng)pH值為5.6，在pH值為5.0～6.8酶活穩(wěn)定性良好。通過(guò)菌株的初步應(yīng)用探究得出，菌株能夠增加麩皮、大曲和糟醅中阿魏酸的釋放量，使得樣品中阿魏酸含量增加，為后續(xù)阿魏酸酯酶在白酒釀造中的應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。