林曉璇，陳林靜，容晨毓，陳凱琪，高桂娟

（廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州510303）

鋪地黍(Panicum repens)廣布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，繁殖能力強(qiáng)，其在干旱、水淹、重金屬脅迫、富營養(yǎng)化水體等環(huán)境條件下，均表現(xiàn)出較好的抗逆性及凈化能力[1-3]，同時(shí)，還表現(xiàn)出一定的飼用價(jià)值。目前，鋪地黍以及相關(guān)屬的植物染色體制片報(bào)道較少[4]，《中國植物志》記錄鋪地黍染色體數(shù)2n=40[5]，但未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道鋪地黍的核型參數(shù)。

染色體核型分析在研究植物的起源、系統(tǒng)演化以及物種間親緣關(guān)系等方面都起著重要意義[6]。不同物種在預(yù)處理、解離以及制片等步驟中采用的方法各有不同，每個(gè)過程都可能對染色體帶來或多或少的影響[7-14]。為獲得更好的鋪地黍染色體制片效果及確定鋪地黍核型公式和不對稱程度，本研究對鋪地黍染色體制片技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化并進(jìn)行核型分析，以期為鋪地黍的起源、演化及遺傳育種提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料鋪地黍采自于廣東省大寶山，整個(gè)試驗(yàn)過程均采用同一株系擴(kuò)繁材料，以水培條件培養(yǎng)，取幼嫩根尖進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 改良的制片技術(shù)

本研究采用改良的壓片法，將去壁低滲–火焰干燥技術(shù)的低滲環(huán)節(jié)加入到壓片技術(shù)中[10,15]，操作流程如圖1 所示；以鋪地黍根尖為材料，從預(yù)處理、固定、前低滲、解離4 個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。

圖 1 改良的壓片操作過程Figure 1 Im proved process of pressure sheet

1.2.2 取材時(shí)間

植物分生組織的生長具有一定周期性，一般認(rèn)為取材應(yīng)選在分裂中期最為合適，通常在08:00?11:00 或13:00?15:00 進(jìn)行[7]；但有研究發(fā)現(xiàn)最佳取材時(shí)間并不具有較好的穩(wěn)定性，且在最佳時(shí)間取材所獲得的分裂中期染色體比例也有較大波動(dòng)[16]。也有學(xué)者指出，不同植物在不同溫度條件下，細(xì)胞的分裂周期是可變的，而用一個(gè)固定的晝夜節(jié)律的概念去理解多變的細(xì)胞周期是缺乏理論依據(jù)而且在實(shí)踐上也不能得到證實(shí)，因此，只要植物的分生組織處在良好活動(dòng)狀態(tài)，在一天中任何時(shí)間取材均可[17]。將鋪地黍的根尖進(jìn)行取樣也證實(shí)，在08:00?18:00 取材均可得到一定數(shù)量可供核型分析的中期細(xì)胞(表1)，并且在根長為0.5 和2 cm 時(shí)分別取材進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)兩者對有絲分裂中期細(xì)胞的數(shù)量并無太大影響，分生區(qū)細(xì)胞成熟程度也未發(fā)現(xiàn)較大區(qū)別?；谖墨I(xiàn)以及方便后續(xù)研究，均在根尖長度為0.5～2 cm 時(shí)，于15:00 左右取材進(jìn)行處理。

1.2.3 預(yù)處理階段優(yōu)化

預(yù)處理的目的在于阻止或破壞紡錘體形成，使有絲分裂被阻斷在中期；也可導(dǎo)致染色體高度濃縮，使染色體變短，從而利于染色體分散。另外，用不同的預(yù)處理方法所得效果不同，如用藥液(如秋水仙素和8-羥基喹啉的混合溶液)預(yù)處理，雖然濃度很低，但它們對細(xì)胞都有毒害作用，這種毒害作用強(qiáng)度隨溫度變化而不同；而用冰水混合物低溫預(yù)處理相對安全，但不適用于所有植物，因?yàn)椴煌参锛?xì)胞的合成、代謝及細(xì)胞分裂對低溫的反應(yīng)不同[17]。預(yù)處理?xiàng)l件的單因素優(yōu)化設(shè)計(jì)：對預(yù)處理進(jìn)行8 種不同條件設(shè)計(jì)，冰水混合物4℃分別設(shè)置12、20、22、24、48h，1?1 溶液(0.002mol·L?18-羥基喹啉溶液?0.0 5%秋水仙素溶液)4℃分別設(shè)置2、3、4 h，每處理5 個(gè)重復(fù)。固定、前低滲和解離統(tǒng)一采用常規(guī)固定條件(卡諾氏固定液Ⅰ、4℃、2 4 h)、常規(guī)前低滲條件(0.075mol·L?1KCl 溶液、25℃、30m in)和常規(guī)解離條件(混合酶液、25℃、4h)[17]，每處理5 個(gè)重復(fù)。

表 1 不同取材時(shí)間對鋪地黍中期細(xì)胞的影響Table 1 Effect of different collection tim es on the metaphase of Panicum repens

1.2.4 固定階段優(yōu)化

固定的目的在于用固定液將細(xì)胞迅速殺死，使蛋白質(zhì)沉淀并盡量使其保持原有狀態(tài)；一般采用卡諾氏固定液Ⅰ(無水乙醇?冰醋酸=3?1)低溫(4℃左右)固定材料；也有使用甲醇替代無水乙醇，但由于甲醇毒性較大，且對細(xì)胞壁和染色體的硬化作用較乙醇強(qiáng)，一般只用于去壁低滲干燥法中[15,17]。固定階段的單因素優(yōu)化設(shè)計(jì)：使用卡諾氏固定液Ⅰ(無水乙醇?冰醋酸=3?1)在4℃條件下，分別固定1、2、12 和24 h 的梯度設(shè)計(jì)。預(yù)處理、前低滲和解離統(tǒng)一采用已獲得的優(yōu)化預(yù)處理?xiàng)l件(冰水混合物4℃預(yù)處理22h)和常規(guī)前低滲條件(0.075mol·L?1KCl溶液、25℃、3 0m i n)、常規(guī)解離條件(混合酶液、2 5℃、4 h)[17]，每處理5 個(gè)重復(fù)。

1.2.5 前低滲階段優(yōu)化

在解離前進(jìn)行前低滲，解離后又進(jìn)行后低滲，水分通過細(xì)胞膜滲入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞膨脹，進(jìn)而使得本來分散的染色體更加分散[18]。利用常規(guī)壓片方法進(jìn)行制片，解離后材料較硬，細(xì)胞較難分散，并且很難將細(xì)胞壓到同一個(gè)平面，所得染色體圖像不清晰；有研究將去壁低滲干燥技術(shù)的低滲加到壓片技術(shù)之中，所得制片效果良好[10,15]；一般使用蒸餾水或0.075mol·L?1KCl 溶液進(jìn)行低滲，處理時(shí)間的長短也因植物的不同而定。前低滲條件的單因素優(yōu)化設(shè)計(jì)：前低滲階段用0.075mol·L?1KCl 溶液在25℃條件下分別設(shè)置5、10、15、20、25、30 及60 m in 共7 個(gè)時(shí)間梯度，預(yù)處理、固定和解離統(tǒng)一采用已獲得的優(yōu)化預(yù)處理?xiàng)l件(冰水混合物4℃預(yù)處理2 2 h)、優(yōu)化固定條件(卡諾氏固定液Ⅰ固定2 4 h)及常規(guī)解離條件(混合酶液、25℃、4h)[17]，每處理5 個(gè)重復(fù)。

1.2.6 解離階段優(yōu)化

解離的目的在于將部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞壁的纖維素和果膠物質(zhì)分解或軟化細(xì)胞壁，易于染色體分散制片；酸解法通常用1mol·L?1HCl 在60℃水浴鍋解離幾分鐘到十幾分鐘或更長；對于難以解離或軟化的材料，也有用無水乙醇和濃鹽酸的混合液進(jìn)行解離；而采用纖維素酶(1%～5%)和果膠酶(1%～3%)的混合溶液去除細(xì)胞壁時(shí)，酶的濃度、質(zhì)量、pH 以及酶解的時(shí)間、溫度都對酶解效果有不同的影響，酶解時(shí)間一般在室溫下2～5 h[15-18]。解離階段的單因素優(yōu)化設(shè)計(jì)：酸解法用濃HCl?95%乙醇=1?1(25℃)分別設(shè)置5、10、15min 和1mol·L?1HCl(60℃)分別設(shè)置5、1 0、1 5m in；酶解法用1%果膠酶和2%纖維素酶(25℃)分別設(shè)置2、3、4 h，共9 種解離條件，預(yù)處理、固定、前低滲統(tǒng)一采用已獲得的優(yōu)化預(yù)處理?xiàng)l件(冰水混合物4℃預(yù)處理2 2 h)、優(yōu)化固定條件(卡諾氏固定液Ⅰ固定2 4 h)及優(yōu)化前低滲條件(0.075mol·L?1KCl 溶液、25℃、前低滲15～20m in)，每處理5 個(gè)重復(fù)。

1.2.7 鏡檢

用OLYMPUSCX22 顯微鏡觀察，選擇30 個(gè)染色體分散且形態(tài)較好的細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)，若85%以上染色體數(shù)目相同時(shí)，即能夠確定染色體數(shù)目[19]；其次選取5 個(gè)分裂相對良好且染色體形態(tài)清晰的細(xì)胞再用佳能相機(jī)借助顯微鏡單反相機(jī)轉(zhuǎn)接口(2X)在油鏡下拍照。

1.2.8 核型分析

選取5 張染色體形態(tài)清晰且無重疊的圖片使用Photoshop 軟件對染色體進(jìn)行測量和配對[20]，用Excel 軟件繪制核型模式圖[21]。核型分析方法依據(jù)李懋學(xué)和陳瑞陽[19]的標(biāo)準(zhǔn)，染色體形態(tài)根據(jù)Levan等[22]的方法歸類，核型不對稱性按照Stebbins[23]的標(biāo)準(zhǔn)劃分。

臂比(r)＝長臂(S)/短臂(L)；染色體絕對長度(μm)＝放大的染色體長度(mm)/放大倍數(shù)×1 000；染色體相對長度(%)＝染色體長度/染色體組總長度×1 0 0%；染色體平均相對長度(%)＝染色體組總相對長度/染色體組總數(shù)；染色體相對長度系數(shù)(Index of relativelength)＝每條染色體相對長度/染色體平均相對長度；平均長度核型不對稱系數(shù)(As.k，%)=長臂總長/全組染色體總長×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理階段優(yōu)化的染色體制片效果

2.1.1 預(yù)處理階段優(yōu)化的染色體制片效果

8 種處理?xiàng)l件中，冰水混合物4℃預(yù)處理2 2 h染色體長度適宜、分散良好、清晰度高(圖2C)，是適合鋪地黍類染色體制片的預(yù)處理方法。冰水混合物4℃預(yù)處理2 0 h 和1?1 溶液4℃處理3 h 條件下會(huì)出現(xiàn)局部黏連現(xiàn)象(圖2B 和圖2G)，或者冰水混 合 物4℃預(yù)處理1 2 h 和1?1 溶 液4℃處理2 h后凝縮程度不足、嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象(圖2A 和圖2F)。而4℃預(yù)處理2 4 h、4 8 h 和1?1 溶液4℃處理4 h的染色體凝縮過度，并出現(xiàn)染色體不同層現(xiàn)象(圖2D、圖2E、圖2H)。

圖 2 不同預(yù)處理?xiàng)l件的單因素試驗(yàn)制片效果Figure 2 Single-factor effect of different pre-treatmentconditions on chromosome preparation

2.1.2 固定階段優(yōu)化的染色體制片效果

4 種處理中，使用卡諾氏固定液Ⅰ(無水乙醇 ?冰醋酸=3?1)在4℃條件下固定2 4 h 細(xì)胞視野清晰，染色體分散，染色效果良好，易于觀察計(jì)數(shù)(圖3D)，即固定24 h 是適合鋪地黍類染色體制片的固定時(shí)間。固定1 h 會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)易染上顏色(圖3A)、固定2 h 細(xì)胞視野清晰但染色體局部黏連(圖3B)、固定12 h 染色深淺不一且局部聚集(圖3C)。

圖 3 不同固定條件的單因素試驗(yàn)制片效果Figure 3 Single-factor effect of different fixed conditions on chromosom e preparation

2.1.3 前低滲階段優(yōu)化的染色體制片效果

用0.075mol·L?1KCl 溶液在25℃條件下前低滲15 和20m in 染色體易于著色，染色體較分散(圖4C和圖4D)，即解離前低滲15～20m in 易于鋪地黍類染色體分散。前低滲5 和25m in 染色體染色效果較好，但染色體較黏連(圖4A 和圖4E)；前低滲10m in的染色體大致分散，但染色效果不佳(圖4B)；前低滲30 和60m in 染色體凝集纏繞嚴(yán)重，難以觀察計(jì)數(shù)(圖4F 和圖4G)。

2.1.4 解離階段優(yōu)化的染色體制片效果

鋪地黍根尖相對較佳的解離條件為1%果膠酶和2%纖維素酶于25℃條件下酶解3 h(圖5H)，經(jīng)此方法處理后，細(xì)胞壁完全溶解，細(xì)胞質(zhì)稀薄，染色體分散且易著色。而用1%果膠酶和2%纖維素酶于25℃條件下酶解2 h，細(xì)胞壁基本溶解，細(xì)胞質(zhì)較薄，染色體易著色但不夠分散(圖5G)；酶解4 h，細(xì)胞壁破壞徹底，細(xì)胞質(zhì)很稀薄，背景清晰，染色體易著色，但根尖易斷裂丟失，導(dǎo)致染色體易缺失(圖5I)。

圖 4 不同前低滲條件的單因素試驗(yàn)制片效果Figure 4 Single-factor effect of different pre-hypotension conditions on chromosome preparation

圖 5 不同解離條件的單因素試驗(yàn)制片效果Figure 5 Single-factor effect of different dissociation conditions on chromosome preparation

采用酸解法所得制片效果較差，在25℃條件下 用濃HCl?9 5%乙醇=1?1 解 離5、1 0min，細(xì) 胞壁均未全部溶解，細(xì)胞質(zhì)厚，細(xì)胞易重疊，染色體聚集且難著色(圖5A 和圖5B)；用濃HCl?95%乙醇=1?1 解離1 5m in 細(xì)胞壁已全部溶解，但細(xì)胞質(zhì)仍較厚，染色體不夠分散，難著色(圖5C)。在60℃條件下用1mol·L?1HCl 解離5m in，細(xì)胞壁全部溶解，細(xì)胞質(zhì)薄，但染色體不夠分散，難著色(圖5D)；解離10min，細(xì)胞壁破壞徹底，細(xì)胞質(zhì)很稀薄，背景干凈，染色體較分散，易著色，但細(xì)胞容易重疊(圖5E)；解離15min，細(xì)胞壁完全溶解、細(xì)胞質(zhì)薄，但染色體不夠分散、著色不均勻(圖5F)。

綜上，將優(yōu)化處理整理如圖6 所示。在根長0.5～2c m、1 5:0 0 時(shí)剪取根尖，采用冰水混合物在4℃條件下預(yù)處理22h 后，于4℃條件下用卡諾氏固定液Ⅰ固定24h，接著用0.075mol·L?1KCl 溶液于25℃條件下前低滲15～20m in，置于1%果膠酶和2%纖維素酶混合酶液于25℃條件酶解3 h，再用蒸餾水于25℃條件后低滲3 0 m i n，于2 5℃條件下用卡諾氏固定液Ⅰ再固定30m in 后使用改良苯酚品紅染液染色8m in，用吸水紙吸取染液，蓋上蓋玻片，對邊輕壓玻片邊緣并用帶橡皮鉛筆頭敲擊。

圖 6 鋪地黍根尖細(xì)胞染色體制片優(yōu)化條件Figure 6 The optim ized conditions for preparing chrom osomes in Panicum repens root tip cells

2.2 鋪地黍核型分析

2.2.1 染色體數(shù)目

鋪地黍染色體數(shù)目為2 n=2 x=40，為二倍體。

2.2.2 核型特征鋪地黍核型公式為2n=2 x=4 0=3 4m+6sm，為中部和亞中部著絲粒染色體，未發(fā)現(xiàn)有隨體(表2、圖7)。染色體絕對長度范圍為10.87～19.21μm，屬于大型染色體。染色體相對長度為3.85～6.81，相對長度組成為2n=40=2L+16M2+22M1；最長與最短染色體長度比值為1.77，臂比值范圍為1.04～2.08，核型不對稱系數(shù)為58.99%，核型類型屬于2A 型。

表 2 鋪地黍染色體核型參數(shù)Table 2 Parameters of the chromosome karyotype of Panicum repens

3 討論

3.1 鋪地黍染色體制片優(yōu)化效果分析

圖 7 鋪地黍中期分裂相(A)、染色體核型(B)及核型模式圖(C)Figure 7 Chromosomes in the metaphase cleavage phase (A), karyotypes (B), and karyotype models (C) of Panicum repens

在染色體制片過程中，每個(gè)過程都可能對染色體的核型參數(shù)帶來影響[24-25]；許多學(xué)者也根據(jù)不同的物種對染色體制片進(jìn)行優(yōu)化[8-14]。良好的染色體制片效果受多方面因素的影響，大量研究表明，預(yù)處理?xiàng)l件是染色體制備的關(guān)鍵步驟之一[26]。有研究發(fā)現(xiàn)冰水混合物不適合用于山藥(Dioscorea oppositifolia)的預(yù)處理[27]；另有研究發(fā)現(xiàn)用對二氯苯飽和溶液和0.003mol·L?18-羥基喹啉將雅礱江冬麻豆(Salweenia bouffordiana)預(yù)處理3 h 的中期染色體形態(tài)良好，更有利于開展核型分析[28]。本研究通過對鋪地黍根尖進(jìn)行不同預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，置于冰水混合物在4℃條件下預(yù)處理2 2 h，染色體凝縮程度適宜、分散良好，其最佳預(yù)處理?xiàng)l件與平邑甜茶(Malus hupehensis var.mengshanensis)的研究結(jié)果一致[29]。

固定的時(shí)間一般為2～24 h，材料小者時(shí)間可短，大者可長，大多植物在4℃條件用卡諾氏固定液Ⅰ固定的效果較好[17]；也有研究發(fā)現(xiàn)青花菜(Brassica oleracea)根尖材料對固定時(shí)間沒有嚴(yán)格的要求，12～24 h 均可[15]。鋪地黍根尖的最佳固定條件是卡諾氏固定液Ⅰ4℃條件固定2 4 h。

有研究將去壁低滲干燥技術(shù)的前低滲環(huán)節(jié)(0.075mol·L?1KCl溶液、25℃、30m in)用于青花菜根尖的壓片法[15]，另有研究將去壁低滲干燥技術(shù)的后低滲(蒸餾水、室溫、30m in)加到白姜花(Hedychium coronarium)、金姜花(H. gardnerianum)等姜科植物根尖的壓片技術(shù)之中，均制得分散良好的染色體裝片，且染色效果好，所制染色體圖像清晰，易于觀察[10]。鋪 地黍 在0.075mol·L?1KCl 溶 液于25℃條件下前低滲15～20m in 的效果最佳，可以獲得濃縮程度適宜且分散的染色體。

有研究將小麥根尖放入預(yù)熱的1mol·L?1HCl 中在60℃的水浴鍋解離7～8 m in，所得材料最適合制片；而酶解法中使用纖維素酶和果膠酶進(jìn)行解離時(shí)，只需在37℃條件下酶解8 m in 左右就可以得到好的分裂相[30]。也有研究發(fā)現(xiàn)用5%纖維素酶和4%果膠酶混合液對尖葉牛樟(Cinnamomum kanehirae)根尖酶解3 h 制片效果最差[25]。對于鋪地黍，用1%果膠酶和2%纖維素酶混合酶液于25℃條件酶解3h 效果最佳；用1mol·L?1HCl60℃水浴加熱發(fā)現(xiàn)，解離10min 就能夠去除細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)，但不易于壓片，細(xì)胞容易發(fā)生重疊，不利于染色體的觀察。

3.2 鋪地黍染色體數(shù)目及核型特征分析

在系統(tǒng)演化上，具有對稱核型的植物屬于較古老或原始類型，而不對稱核型往往出現(xiàn)在進(jìn)化水平較高或特化的植物中，并且具有較相似核型的物種往往親緣關(guān)系較近。核型不對稱系數(shù)越接近50%，表明核型的對稱程度越高，進(jìn)化程度就越原始[23,31]。而鋪地黍的核型不對稱系數(shù)為58.99%，接近50%，具有較大的對稱性，核型為2A 型，表明鋪地黍在進(jìn)化類型上可能屬于原始類型。

一種植物染色體的核型、數(shù)目是穩(wěn)定的，具有自我復(fù)制的能力，并且作為決定物種繁衍的遺傳物質(zhì)的載體[32]。但也有學(xué)者認(rèn)為，預(yù)處理、固定、酸解離或酶解離、普通壓片時(shí)對材料施加的外力等各個(gè)環(huán)節(jié)的掌握不同會(huì)導(dǎo)致染色體伸長或縮短的程度不同，并且在測量時(shí)由于著絲點(diǎn)的位置辨認(rèn)不清也可能導(dǎo)致長臂與短臂的測量結(jié)果不準(zhǔn)確；染色體本身結(jié)構(gòu)的差異可能導(dǎo)致同一條染色體有的部位染色深，有的部位染色淺，這些都有可能致使染色體核型出現(xiàn)差異[8]。另外，雖然有些植物對重金屬具有一定的耐受性，但當(dāng)環(huán)境中重金屬離子超過臨界值時(shí)，就會(huì)對植物的生理生化特性產(chǎn)生很大影響；在自然條件或人工因素的重金屬影響下，可能導(dǎo)致染色體變異或DNA 的損傷，染色體變異表現(xiàn)為，一些染色體的數(shù)目增加或減少，一些染色體會(huì)出現(xiàn)斷裂，然后會(huì)再一次的異常連接等[33-34]。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)鋪地黍根尖的臨時(shí)裝片在顯微鏡下觀察時(shí)有時(shí)出現(xiàn)大小差異；在幾組核型參數(shù)中也發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)上存在差異，本研究中所使用的鋪地黍材料長期在大寶山重金屬尾礦地生長，其生長條件[35]是否對其有影響，有待于進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

鋪地黍染色體制片的優(yōu)化條件為:冰水混合物4℃預(yù)處理2 2 h，卡諾氏固定液Ⅰ4℃固定2 4 h，0.075mo l·L?1KCl 溶液25℃前低滲15～20m in，用1%果膠酶和2%纖維素酶混合酶液25℃酶解3 h效果最佳。鋪地黍核型公式為2n=2 x=4 0=3 4m+6sm，未發(fā)現(xiàn)有隨體，屬于大型染色體；核型不對稱系數(shù)為58.99%，核型類型屬于2A 型，在進(jìn)化類型上可能屬于原始類型。