黃 石，段賢春，潘凌宇，陳 燕1，，汪永忠

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院，2.第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 合肥 230031)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜增生、關(guān)節(jié)破壞為特點(diǎn)的自身免疫系統(tǒng)疾病，主要影響外周關(guān)節(jié)，也可累及關(guān)節(jié)外器官，如皮膚、心臟、肺、眼睛等[1]；其病理變化主要從關(guān)節(jié)滑膜的破壞開始，隨之出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨、骨破壞，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙，甚至關(guān)節(jié)功能喪失。RA的發(fā)病機(jī)理尚不明確，西醫(yī)治療主要應(yīng)用非甾體抗炎藥、改善病情的抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等，雖然這些藥物能有效控制RA的發(fā)作，極大的提高RA的臨床療效，但其副作用較多，患者依從性不高，所以尋找新的治療方法極具意義。而中藥因其治療RA療效顯著、副作用小、耐受性好，近年來日益受到關(guān)注。

桃紅四物湯出自清代吳謙等所著的《醫(yī)宗金鑒》，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、熟地、白芍、川芎六味中藥組成。桃紅四物湯的功效為活血化瘀、養(yǎng)血補(bǔ)血，臨床常在該方基礎(chǔ)上進(jìn)行藥味加減，用于治療婦科、心腦血管及RA等疾病，F(xiàn)u等[2]發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯通過Wnt/IP3R/CAMKII途徑減輕缺血再灌注大鼠成肌細(xì)胞鈣超載和炎癥反應(yīng)；Duan等[3-4]運(yùn)用質(zhì)譜分析技術(shù)得到桃紅四物湯入血及入腦成分，再結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)揭示桃紅四物湯治療實(shí)驗(yàn)性大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞的潛在靶點(diǎn)；李肖等[5]將桃紅四物湯與麻黃附子細(xì)辛湯通過加減治療RA，療效顯著。但桃紅四物湯發(fā)揮治療RA作用的藥效機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性與中醫(yī)藥的整體觀、辯證論等基本理論相吻合，應(yīng)用于中醫(yī)藥可以很好的闡述其物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制[6]。據(jù)此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究手段，探討桃紅四物湯治療RA的可能作用機(jī)制，為RA的治療提供思路和參考。

1 材料與方法

1.1 桃紅四物湯活性成分的獲取基于課題組前期超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MSE)收集的桃紅四物湯體外化學(xué)成分[7]，并與中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(TCMSP)中的結(jié)果進(jìn)行整合，得到可能存在于桃紅四物湯中的化合物。將這些化合物按照口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、類藥性(drug-like, DL)≥0.18進(jìn)行篩選，選出最可能發(fā)揮作用的有效活性成分。

1.2 桃紅四物湯成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)使用Zinc網(wǎng)站(zinc.docking.org)和PubChem網(wǎng)站(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載活性成分的mol2文件或SDF文件，將其上傳至PharmMapper數(shù)據(jù)庫(www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)，PharmMapper可以對(duì)成分的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，勾選“Homo Sapiens”，等待預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.3 RA疾病靶點(diǎn)的獲取通過OMIM數(shù)據(jù)庫(http://omim.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org)搜索“rheumatoid arthritis”，獲取RA靶點(diǎn)。

1.4 藥物成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)映射獲得桃紅四物湯相關(guān)靶點(diǎn)以及RA的靶點(diǎn)之后，取兩者的交集靶點(diǎn)蛋白，這樣可提高篩選靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，增大結(jié)果的可信性，再用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，利用軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，桃紅四物湯的成分和靶點(diǎn)是網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)(node)，邊(edge)代表中藥成分和其作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。根據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果篩選出桃紅四物湯作用于RA的關(guān)鍵化合物。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將獲得的交集靶點(diǎn)上傳至 STRING 數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，將蛋白種類設(shè)置為人源，最低相互作用閾值(minimumrequired interaction score)設(shè)置為“highest confidence(0.900)”，同時(shí)設(shè)置隱藏游離點(diǎn)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。下載PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，借助其“Network Analyzer”功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，度?degree)、介數(shù)(betweenness centrality，BC)均大于平均值的節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 富集分析及“桃紅四物湯-組方藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將“1.4”項(xiàng)結(jié)果中的交集靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集，其中GO分析包括生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)以及分子功能(molecular function，MF)3個(gè)部分，設(shè)定FDR值獲得GO與KEGG富集結(jié)果，根據(jù)富集結(jié)果做氣泡圖。利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“桃紅四物湯-組方藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”圖。

1.7 關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證將“1.4”項(xiàng)結(jié)果中排名前三的關(guān)鍵化合物在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取其mol2格式文件，PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前三的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)中獲取其結(jié)構(gòu)，利用AutoDock vina軟件將關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，以結(jié)合能作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，并用pymol軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行展示。

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物湯活性成分篩選桃紅四物湯所含107種有效成分經(jīng)篩選后，共得到38個(gè)活性成分，其中桃仁3個(gè)、紅花6個(gè)、當(dāng)歸18個(gè)、熟地2個(gè)、白芍3個(gè)、川芎16個(gè)，熟地與紅花的共有成分1個(gè)，川芎與當(dāng)歸的共有成分7個(gè)，白芍、紅花與熟地的共有成分1個(gè)，見Tab 1。

Tab 1 The active ingredients of Tao-Hong-Si-Wu decoction

2.2 桃紅四物湯活性成分-靶點(diǎn)篩選整合PharmMapper網(wǎng)站上桃紅四物湯相關(guān)靶點(diǎn)，得到8 450個(gè)。去除重復(fù)值后，得到相關(guān)人類基因靶點(diǎn)共441個(gè)。

2.3 疾病-靶點(diǎn)篩選在OMIM數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索“rheumatoid arthritis”，獲取RA疾病靶點(diǎn)，剔除重復(fù)，共得到4 167個(gè)。

2.4 藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的映射將桃紅四物湯活性成分對(duì)應(yīng)的441個(gè)作用靶點(diǎn)與4 167個(gè)RA相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到桃紅四物湯潛在作用于RA疾病靶點(diǎn)291個(gè)，如下Fig 1，其中桃仁對(duì)應(yīng)169個(gè)，紅花對(duì)應(yīng)196個(gè)，當(dāng)歸對(duì)應(yīng)237個(gè)，熟地對(duì)應(yīng)163個(gè)，白芍對(duì)應(yīng)203個(gè)，川芎對(duì)應(yīng)225個(gè)，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中有329個(gè)節(jié)點(diǎn)(桃紅四物湯中化合物節(jié)點(diǎn)38個(gè)，靶點(diǎn)基因節(jié)點(diǎn)291個(gè))，5 037條邊。在網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值表示網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點(diǎn)相連線的條數(shù)，度值越大則表示該化合物發(fā)揮作用的可能性越大。利用Cytoscape 3.7.1中的“Network Analyzer”對(duì)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的特性進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的平均度值為129.153 8，平均介數(shù)為0.024 8。度值、介數(shù)均超過平均值的化合物節(jié)點(diǎn)有11個(gè)，見Tab 2，推測(cè)這些化合物可能是桃紅四物湯發(fā)揮治療RA作用的關(guān)鍵化合物。

Fig 1 Intersection of predicted targets of THSWD and RA

2.5 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選將“2.4”項(xiàng)下得到的291個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)?STRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction Networks，PPI)網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)中包含232個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 046條邊，表明該網(wǎng)絡(luò)中有232個(gè)靶點(diǎn)可以發(fā)生相互作用，共產(chǎn)生1 046次相互作用關(guān)系。拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)顯示，網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的平均度值為9.017 2，平均介數(shù)為0.010 1。度值、介數(shù)均超過平均值的節(jié)點(diǎn)有33個(gè)，由Cytoscape軟件進(jìn)行可視化展示，其中，節(jié)點(diǎn)大小與顏色表示度值的大小，節(jié)點(diǎn)越大，對(duì)應(yīng)的度值越大，如Fig 2所示，靶點(diǎn)具體信息見Tab 3，推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是桃紅四物湯治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

Tab 2 Basic information of hubcompounds of THSWD in RA treatment

2.6 富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)桃紅四物湯治療RA的291個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析以及KEGG信號(hào)通路富集分析(FDR<0.01)，GO富集分析中包括BP的相關(guān)條目59個(gè)；MF的相關(guān)條目32個(gè)；CC的相關(guān)條目15個(gè)。BP主要包括凋亡過程的負(fù)調(diào)控、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、肽基酪氨酸自磷酸化等；MF主要包括類固醇激素受體、蛋白酪氨酸激酶活性等；CC主要包括胞漿、胞外體等。將篩選出的前10個(gè)BP、MF、CC通過R語言相關(guān)程序作氣泡圖，見Fig 3。KEGG通路富集篩選得到34條信號(hào)通路(FDR<0.01),與RA相關(guān)的通路有FoxO,Ras及VEGF等14條，見Fig 4。

2.7 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將桃紅四物湯治療RA的38個(gè)成分，291個(gè)靶點(diǎn)以及KEGG富集分析的14條可能與RA相關(guān)的通路等構(gòu)建“桃紅四物湯-組方藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)圖，如Fig 5所示。

2.8 分子對(duì)接驗(yàn)證選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前3的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白(MAPK1、SRC、PIK3R1)與表2的排名前3的關(guān)鍵活性成分(Hydroxysafflor-Yellow-A、Rutin、Kaempferol)進(jìn)行對(duì)接，見Tab 4，其中Rutin與SRC的結(jié)合性最好，pymol可視化后見Fig 6。

3 討論

RA在中醫(yī)理論中屬于“痹證”的范疇，主要由于機(jī)體氣血虛弱、正氣不足，導(dǎo)致風(fēng)寒濕邪侵襲機(jī)體，停滯于肌肉筋膜、骨骼關(guān)節(jié)，加之寒邪收澀凝結(jié)，最后引起關(guān)節(jié)重著、冷痛、屈伸受限，甚至關(guān)節(jié)變形的一種慢性疾患[8]。《類證治裁·痹證》說：“痹久必有瘀血”，祖國醫(yī)學(xué)亦有“不通則痛，通則不痛”之言。作為活血化瘀的代表方劑桃紅四物湯，可使RA患者關(guān)節(jié)經(jīng)絡(luò)中的瘀滯消失從而減輕疼痛?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，桃紅四物湯有抑制骨質(zhì)疏松、填充骨髓等功效，可使RA患者的骨質(zhì)疏松化恢復(fù)正常，還可以降低炎癥，使毛細(xì)血管有充分的通透性，減少炎癥滲出，改善血液循環(huán)，促進(jìn)炎癥吸收[9]。

Tab 3 Basic information of hub targets of THSWD in RA treatment

Tab 4 Molecular docking results

通過對(duì)38個(gè)成分和291個(gè)交集靶點(diǎn)構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，結(jié)果表明成分中的羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor-yellow-A)、山奈酚(kaempferol)等11個(gè)化合物可能是桃紅四物湯發(fā)揮治療RA作用的關(guān)鍵活性成分。羥基紅花黃色素A已被證實(shí)可緩解多種炎癥因子的表達(dá)，姚弘毅等[10]發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A可通過降低骨性關(guān)節(jié)炎大鼠不同部位相關(guān)炎癥因子含量及抑制Notch1信號(hào)通路激活進(jìn)而減輕軟骨損傷。山奈酚[11]可通過阻斷MAPK通路和生長因子受體3-核糖體S6激酶2信號(hào)軸，來發(fā)揮治療RA作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，桃紅四物湯治療RA的核心靶點(diǎn)包括AKT1、MAPK1、JAK2等。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的家族成員之一，AKT1可調(diào)控mTOR信號(hào)通路，減少細(xì)胞凋亡，上調(diào)AKT1蛋白的表達(dá)，可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖[12]。MAPK1即絲裂原活化蛋白激酶1，MAPK參與了RA關(guān)節(jié)的炎癥和組織破壞，與RA病理狀態(tài)的維持及病情進(jìn)展密切相關(guān)。JAK2屬于酪氨酸蛋白激酶家族，RA患者滑膜中細(xì)胞因子與JAK2結(jié)合，從而激活JAK/STAT信號(hào)通路，致使關(guān)節(jié)破壞，鄧龍飛等[13]發(fā)現(xiàn)威靈仙總皂苷通過抑制滑膜組織中JAK2mRNA表達(dá)及p-JAK2/JAK2 相對(duì)表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)揮治療RA作用。以上結(jié)果提示，桃紅四物湯可能通過調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡、炎癥細(xì)胞因子激活、細(xì)胞自噬或凋亡等途徑的靶點(diǎn)發(fā)揮治療RA作用。

Fig 2 PPI network of THSWD in treating potential targets of RA

Fig 3 Bubble diagram of GO function enrichment of potential targets from THSWD for RA treatment

Fig 4 Bubble diagram of KEGG enrichmentof potential targets from THSWD for RA treatment

KEGG通路富集結(jié)果表明，桃紅四物湯通過調(diào)控FoxO、Ras及VEGF等信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)RA的治療效果，其中已有多條通路被證實(shí)參與了RA的發(fā)生發(fā)展。FoxO屬于叉頭框蛋白(forkhead box，F(xiàn)OX)家族中的一個(gè)亞類，當(dāng)機(jī)體刺激FoxO時(shí)，修復(fù)和自由基清除等功能的基因表達(dá)，使細(xì)胞凋亡、修復(fù)和降解的轉(zhuǎn)錄程序啟動(dòng)，同時(shí)幾種前凋亡基因也誘導(dǎo)損傷或異常細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。一般而言，氧化應(yīng)激的信號(hào)匯集到下游，激活效應(yīng)器caspase-3，活化的caspase-3剪切Akt，引起PI3K/Akt抑制，進(jìn)而促進(jìn)FoxOs蛋白轉(zhuǎn)位入核，激活其轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)前調(diào)亡基因(如Bim和Fas)和細(xì)胞生長停滯與DNA損傷修復(fù)基因(Gadd45a)的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞調(diào)亡，從而清除受損或異常的細(xì)胞。RA進(jìn)程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)通常伴隨著FoxO3a蛋白含量的變化，且FoxO3a的活性被抑制，則谷胱甘肽過氧化物酶表達(dá)降低，使ROS的清除減少，機(jī)體的抗氧化能力減弱[15]。

Fig 5 “THSWD-prescription composition-prototype components- targets- pathways” network

Fig 6 Molecular docking diagram

Ras是單聚體鳥苷三磷酸結(jié)合蛋白，Ras能廣泛激活MAPK等通路對(duì)細(xì)胞凋亡起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，一些藥物可能就是通過Ras信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)發(fā)揮治療RA作用。另有研究表明[16],Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路不僅能夠直接通過上調(diào)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)自噬，而且還能通過間接激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)自噬的發(fā)生。VEGF即血管內(nèi)皮生長因子，VEGF在RA患者滑液和血清中大量表達(dá)，在炎癥發(fā)生時(shí)，VEGF的分泌可增高3～20倍，直接參與了滑膜血管新生，李夢(mèng)等[17]發(fā)現(xiàn)鐵筷子醇提物可通過下調(diào)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)VEGF的表達(dá)發(fā)揮治療作用。

分子對(duì)接結(jié)果，靶點(diǎn)蛋白與活性成分之間的結(jié)合活性度越高，結(jié)合能越小，表示其對(duì)接性越好，一般≤-5.0 kJ·mol-1則表示具有較好的結(jié)合性[18]，從結(jié)果可以看出，桃紅四物湯的主要活性成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合能均<-5.0 kJ·mol-1，推測(cè)這些活性成分在治療RA中發(fā)揮重要作用。

綜上，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果顯示桃紅四物湯通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路共同實(shí)現(xiàn)對(duì)RA的治療作用。這些靶點(diǎn)和通路主要涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長因子等，提示桃紅四物湯治療RA的作用機(jī)制與干預(yù)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生相關(guān)，為后期桃紅四物湯治療RA的深入研究提供基礎(chǔ)。