馬紫童，王雪帆，唐秀鳳，高瑩瑩，王 瀚，劉仁慧,2*

（1.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069；2.中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069）

隨著時代的發(fā)展，人口老齡化的趨勢日益明顯[1-2]。延緩衰老以減輕慢性疾病的發(fā)病在人口日益老齡化的社會，具有重要的意義[3]。衰老自由基學說（free radical theory of aging，F(xiàn)RTA）是現(xiàn)代醫(yī)學闡述衰老發(fā)病機制的一個重要學說，認為人體在生理活動過程中一定會產生自由基，自由基連鎖反應導致膜損傷和生物分子交聯(lián)，損害蛋白質、DNA 等，并且損傷的蛋白質、DNA 逐漸累積，誘發(fā)有關的老年性疾病[4]。中醫(yī)認為衰老的機制與五臟虛虧關系密切，尤其是腎虛一直居于主導地位[5-6]。淫羊藿、女貞子是常用的延緩衰老的補腎中藥，二者配伍是國家級名老中醫(yī)李世增教授積50 余年的臨床經驗總結的常用于延緩衰老的藥對。前期實驗研究表明，淫羊藿和女貞子配伍對于慢性衰老相關疾病骨質疏松及慢性肺部疾病哮喘均有顯著療效[7-8]。本研究基于上述認識，選擇自然衰老大鼠模型，通過檢測心、肺組織的病理改變及自由基水平的改變，結合神經網絡模型評價藥物的綜合作用，探討中藥淫羊藿和女貞子單用及配伍對心肺組織衰老的作用。

1 實驗材料

SPF 級3 月齡（8 只）、6 月齡組（8 只）、8 月齡（56 只）健康雄性SD 大鼠，由北京維通利華實驗動物技術股份有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2016-0006，動物倫理號：AEEI-2016-178。電動勻漿機（上海精密儀器儀表有限公司）；SpectraMax Plus 385 全波長酶標儀（Molecular Devices）；全自動生化儀（日本奧林巴斯株式會社，型號：AU480）；尼康（Nikon）ECLIPSE 80i 生物顯微鏡及NIS-Elements BR 3.2 圖像分析軟件（北京銳馳恒業(yè)儀器科技有限公司）?？偪寡趸芰Γ╰otal antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒（貨號：A015-1）、一氧化氮（Nitric oxide，NO）測定試劑盒（貨號：A013-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（貨號：A003-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（貨號：A001-3）均購于南京建成生物工程研究所；中藥材炙淫羊藿及中藥材酒女貞子購于北京同仁堂藥店。

2 方法

2.1 分組及給藥 8 月齡大鼠隨機分為7 組，包括9月齡組、12 月齡組、15 月齡組、17 月齡組，淫羊藿、女貞子組（配伍組）、淫羊藿組、女貞子組，每組8 只。SPF 級3 月齡（8 只）、6 月齡（8 只）作為青年對照組。17 月齡組、淫羊藿組、女貞子組、配伍組正常飼養(yǎng)至15 月齡后分別給予等體積的蒸餾水、淫羊藿煎劑2 g/kg、女貞子煎劑1.5 g/kg、淫羊藿、女貞子煎劑3.5 g/kg（相當于臨床等效劑量）灌胃，連續(xù)2 個月。

2.2 標本采集與檢測 3、6 月齡組大鼠購買后適應環(huán)境1 周后處死；9、12、15、17 月齡組飼養(yǎng)至相應月齡后處死；各給藥組飼養(yǎng)至17 月齡后處死。禁食16 h后，稱重。腹腔麻醉后，剖取心肺組織，稱重，計算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質量（g）/體質量（g）；每組取7 只樣本，固定于10% 甲醛溶液內，進行組織HE 染色切片，每張切片在200 倍鏡下選取3 個不同的視野進行測量病理學參數(shù)，計算平均值。肺組織病理學參數(shù)：參照文獻[9]計算標準化氣道總管壁厚度（Wat）和標準化平滑肌厚度（Wam）。心組織病理學參數(shù)：參考文獻[10]測量間隙寬度，計算心肌纖維間隙和心肌細胞面積百分比。制備10%心肺組織勻漿，采用考馬斯亮藍法測定勻漿上清中蛋白含量；微板法測定組織NO 水平；比色法測定組織T-AOC 水平；WST-1 法測定組織SOD 水平；TBA 法測定組織MDA 水平。以上檢測均按照測試盒說明書進行。

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0 for Windows 軟件包完成，數(shù)據(jù)采用均數(shù) ± 標準差（）表示，組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗結果選擇LSD（方差齊）或Tamhane’s T2（方差不齊）。綜合分析采用多層感知神經網絡分析。

3 結果

3.1 大鼠肺臟指數(shù)及病理的增齡性改變及淫羊藿、女貞子對其的影響 見表1、表2、圖1。與3月齡大鼠比較，其余各月齡組肺臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05 或0.01）；此外，12 月齡組肺臟指數(shù)較6 月齡組顯著降低（P＜0.05）。分別與3、6 月齡青年大鼠比較，12、15、17月齡組大鼠肺臟病理參數(shù)Wat及Wam均顯著升高（P＜0.05 或0.01）。與17 月齡衰老大鼠比較，淫羊藿組和配伍組Wat 及Wam 均顯著降低（均P＜0.01），且配伍組與女貞子單用組比較有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）。

表1 不同月齡組大鼠肺臟指數(shù)及病理學的比較（）

表1 不同月齡組大鼠肺臟指數(shù)及病理學的比較（）

注：與3 月齡組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與6 月齡組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與9 月齡組比較，▲P ＜0.05肺臟指數(shù)：n=8；肺臟病理參數(shù)：n=7

3.2 大鼠肺臟T-AOC、SOD、MDA 和NO 的增齡性改變及淫羊藿、女貞子對其的影響 見表3、表4。不同年齡組大鼠肺臟T-AOC、SOD、NO 水平在6 月齡組達到峰值，之后隨著月齡的增加而逐漸降低（均P＜0.01）；MDA 水平在6 月齡最低，之后隨著月齡的增加而逐漸升高（均P＜0.01）。與17 月齡老年大鼠比較，各用藥組大鼠肺組織T-AOC水平均顯著升高（均P＜0.01）。此外，配伍組肺組織T-AOC 水平較淫羊藿組降低（P＜0.01）。

表2 淫羊藿女貞子對衰老大鼠肺臟指數(shù)及病理學的影響（）

表2 淫羊藿女貞子對衰老大鼠肺臟指數(shù)及病理學的影響（）

注：與17 月齡組比較，## P ＜0.01；與配伍組比較，△P ＜0.05肺臟指數(shù)：n=8；肺臟病理參數(shù)：n=7

圖1 各組大鼠肺臟病理HE 染色照片（×200）

表3 不同月齡大鼠肺臟T-AOC、SOD、MDA 和NO 的比較（，n=8）

表3 不同月齡大鼠肺臟T-AOC、SOD、MDA 和NO 的比較（，n=8）

注：與3 月齡組比較，## P ＜0.01；與6 月齡組比較，△△P ＜0.01；與9 月齡組比較，▲▲P ＜0.01；與12 月齡組比較，□□P ＜0.01；與15 月齡組比較，■■P ＜0.01

表4 淫羊藿女貞子對衰老大鼠肺臟T-AOC、SOD、MDA 和NO 的影響（，n=8）

表4 淫羊藿女貞子對衰老大鼠肺臟T-AOC、SOD、MDA 和NO 的影響（，n=8）

注：與17 月齡組比較，## P ＜0.01；與配伍組比較，△△P ＜0.01

3.3 大鼠心臟指數(shù)及病理的增齡性改變及淫羊藿女貞子的影響 見表5、表6、圖2。

表5 不同月齡組大鼠心臟指數(shù)及病理參數(shù)的比較（）

表5 不同月齡組大鼠心臟指數(shù)及病理參數(shù)的比較（）

注：與3 月齡組比較，## P ＜0.01；與6 月齡組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。心臟指數(shù)：n=8；心臟病理參數(shù)：n=7

與3 月齡組比較，除6 月齡組外各組心臟指數(shù)均顯著降低（均P＜0.01），各組心肌纖維間隙均增加，但心肌細胞面積百分比降低（均P＜0.01）。與6 月齡組比較，9 月齡之后各組心臟指數(shù)降低（P＜0.05或0.01），心肌纖維間隙均顯著增加（均P＜0.01）。與17 月齡衰老大鼠比較，配伍組心臟指數(shù)及心肌細胞面積有顯著性差異（均P＜0.01）；各給藥組的心肌纖維間隙顯著降低（均P＜0.01）。與淫羊藿組比較，配伍組能顯著降低心肌纖維間隙，并增加心肌細胞面積（P＜0.05 或0.01）。

表6 淫羊藿女貞子對衰老大鼠心臟指數(shù)及病理參數(shù)的影響（）

表6 淫羊藿女貞子對衰老大鼠心臟指數(shù)及病理參數(shù)的影響（）

注：與17 月齡組比較，## P ＜0.01；與配伍組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。心臟指數(shù)：n=8；心臟病理參數(shù)：n=7

圖2 各組大鼠心臟病理HE 染色照片（×200）

3.4 大鼠心臟T-AOC、SOD、MDA 和NO 的增齡性改變及淫羊藿、女貞子對其的影響 見表7、表8。大鼠心臟T-AOC、SOD 水平在6 月齡組達到峰值，之后隨著月齡的增加而逐漸降低（均P＜0.01）；MDA 水平在6 月齡最低，之后隨著月齡的增加而逐漸升高（均P＜ 0.01）；NO 水平在9 月齡達到峰值，之后隨著月齡的增加而逐漸降低（均P＜0.01）。與17 月齡老年大鼠比較，各用藥組對心臟T-AOC、SOD、MDA 和NO 水平均無顯著影響。

3.5 基于神經網絡模型評價淫羊藿、女貞子對大鼠心肺衰老的綜合作用 對6 個不同月齡組的14 項檢測指標應用多層感知（multi-layer perceptron，MLP）神經網絡分析，其中訓練樣本34，測試樣本14 個，得到的模型訓練樣本相對錯誤預測0.9%，測試樣本相對錯誤預測1.6%。利用此模型對給藥各組樣本的14 項數(shù)據(jù)進行預測。與17 月齡組的預測值（16.84 ± 0.18）月比較，配伍組預測值（11.82 ± 1.14）月顯著降低（P＜0.01）。與配伍組比較，淫羊藿組預測值（15.41±0.38）、女貞子預測值（14.98±0.46）具有顯著性差異（均P＜0.01）。根據(jù)輸入指標對網絡的影響程度，見圖3。可知肺臟MDA、心肌纖維間隙、心臟SOD、心臟MDA等指標是本神經網絡模型中較為重要的影響因素。

表7 不同月齡大鼠心臟T-AOC、SOD、MDA 和NO 的比較（，n=8）

表7 不同月齡大鼠心臟T-AOC、SOD、MDA 和NO 的比較（，n=8）

注：與3 月齡組比較，## P ＜0.01；與6 月齡組比較，△△P ＜0.01；與9 月齡組比較，▲▲P ＜0.01；與12 月齡組比較，□□P ＜0.01；與15 月齡組比較，■■P ＜0.01

表8 淫羊藿女貞子對衰老大鼠心臟T-AOC、SOD、MDA 和NO 的影響（，n=8）

表8 淫羊藿女貞子對衰老大鼠心臟T-AOC、SOD、MDA 和NO 的影響（，n=8）

圖3 MLP 輸入變量的重要性分析

4 討論

自由基[11]是機體內一類獨立存在、含活潑不成對電子的特殊物質，是機體生命活動中各種生化反應的中間代謝產物。機體防御系統(tǒng)具有高度化學活性，正常情況下，機體中各種抗氧化酶和小分子非酶抗氧化劑與自由基的產生處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但隨著年齡增長，自由基過?；蚩寡趸瘎┤狈Φ仁股锬そY構遭到破壞、細胞器功能出現(xiàn)障礙，繼而損傷蛋白質、脂質等生物大分子物質。衰老的自由基學說[12]認為，在機體代謝過程中，自由基水平的增加或抗氧化劑的缺失使機體抗氧化能力下降和細胞毒性增加，最終造成不可逆的損傷[13]。

祖國醫(yī)學則認為五臟皆虛是衰老之本[14]。心肺同居上焦。肺主氣，隨著年齡的增長，肺氣不足則導致機體氣機的紊亂，影響氣血津液的分布，從而使機體失養(yǎng)，堆積痰、瘀、毒等病理產物而加速衰老[15]。心主血脈，心血瘀阻可導致衰老，且衰老時心氣不足，心神失養(yǎng)，則五臟六腑功能都會受到影響，臟腑日漸衰退，最終導致衰老或加重衰老的進程[16]。本實驗通過HE 染色不同月齡大鼠心肺組織，發(fā)現(xiàn)肺組織中支氣管壁及平滑肌厚度隨年齡增加而增加，提示通氣阻力加大，肺主呼吸的功能受影響；心臟中心肌纖維間隙隨年齡增加而增大，心肌細胞面積百分比隨年齡增加而降低，提示心功能出現(xiàn)增齡性的減退。同時自然衰老大鼠心肺組織中自由基水平隨著年齡的增長而逐漸增加，抗氧化能力卻逐漸降低，提示自由基損傷可能是導致心肺功能降低的一個重要原因。

腎為先天之本，人體生長、發(fā)育、衰老至死亡的過程就是腎氣逐漸充實、隆盛、虧虛乃至衰竭的過程[17]，故補腎是中醫(yī)延緩衰老的主要方法。淫羊藿具有補腎陽的功效，研究表明其延緩衰老的作用與抗氧化、降脂、調節(jié)免疫、改善學習記憶能力，提高心血管功能及生殖功能等有關[18-19]；女貞子具有滋補肝腎之陰的功效，研究表明其延緩衰老的作用與抗氧化、護肝、抗炎、降脂、調節(jié)免疫、抗骨質疏松等藥理作用有關[20-21]。淫羊藿、女貞子配伍可平補腎中陰陽，是國家級名老中醫(yī)李世增教授常用于治療衰老相關疾病的基本藥對組合，李老認為二藥可通過滋養(yǎng)腎精，調節(jié)臟腑氣血而達到延緩衰老的作用。

本研究采用自然衰老大鼠模型，探討補腎中藥對自然衰老大鼠心肺組織退行性病理改變及氧化損傷的作用。結果證實淫羊藿、女貞子配伍能顯著改善老年大鼠心、肺組織退行性的病理改變，且對肺組織病理的改善作用優(yōu)于女貞子單用，而對心臟病理改善作用優(yōu)于淫羊藿單用。此外，二者配伍可以顯著增加肺內T-AOC 水平，但對肺內SOD、MDA、NO 水平均無明顯作用，對心臟MDA、SOD、T-AOC、NO 無明顯作用?；谏窠浘W絡模型綜合評價了淫羊藿、女貞子單用及配伍的作用，證實配伍組對心肺衰老改變的作用優(yōu)于淫羊藿、女貞子的單用。淫羊藿、女貞子均主歸肝腎二經，腎屬水，為氣之根，金水相生；水火既濟，心腎通過復雜的生理病理機制相互影響，相互作用；肝屬木，木生火；肝肺生理相關，病理相連。淫羊藿、女貞子配伍可能通過補腎、調節(jié)肝的功能以延緩心肺二臟衰老，但對心肺病理學的改善作用與抗氧化作用關系并不密切，可能通過其他的途徑，有待于進一步研究。