王麗芬，姚艷玲，崔景軍

（1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安 710000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；3.滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000）

腦梗死（cerebral infarction），全球死亡率高達(dá)11%，且幸存者永久性殘疾的發(fā)生率高[1-2]，已成為威脅人類生命健康的首要疾病。但臨床治療手段仍然非常有限，挽救梗死周邊的缺血半暗帶區(qū)尚未完全壞死的神經(jīng)、血管的功能是現(xiàn)代治療的基礎(chǔ)，但其可逆性受治療時(shí)間窗（TTW）的限制，一般不超過6 h[3]。研究表明，基于炎癥、氧化應(yīng)激等化學(xué)原因，西藥因治療目的單一及不良反應(yīng)多，通常難以獲得令人滿意的臨床結(jié)局[4]。因此，探索更有效的治療手段迫在眉睫。神經(jīng)功能的恢復(fù)依賴于血流供應(yīng)，在急性缺血期改善腦循環(huán)非常重要，血管新生被認(rèn)為是一種潛在的治療策略。研究發(fā)現(xiàn)，針刺人中穴能在腦梗死（MCAO）后早期促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，改善腦組織供血[5]，但其機(jī)制不明，有待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 5～6 周齡健康雄性Wistar 大鼠160 只，體質(zhì)量180～200 g，SPF 級(jí)；西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。根據(jù)信封法產(chǎn)生隨機(jī)序列，分為模型組50 只、針刺組50 只、假手術(shù)組50 只、空白對(duì)照組10 只。前3 組又按術(shù)后3 h、12 h、24 h、2 d、3 d各分為5 個(gè)時(shí)相，每時(shí)相各10 只。

1.2 主要試劑與儀器 華佗牌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；G6805-2A 型華誼電針儀（上海華誼醫(yī)用儀器有限公司）；生物潔凈工作臺(tái)BCM-IOOOA 型（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；離心機(jī)3K18 型（SIGMA，德國(guó)）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司）；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽（美國(guó)伯樂公司）；Lab WorksTM 凝膠成像及分析系統(tǒng)（UVP，美國(guó)）；Realtime PCR 儀（Roche LightCycler 480，瑞士）；高倍倒置電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；酶標(biāo)儀（鄭州博賽生物技術(shù)有限公司）；高壓蒸汽消毒鍋（山東新華安得醫(yī)療用品有限公司）；GIS-2008 數(shù)碼凝膠圖像分析處理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；PBS（北京中杉生物公司）；RIPA 裂解液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；ECL 發(fā)光試劑盒（美國(guó)MillPore 公司）；丙烯酰胺、甲叉聚丙烯酰胺、SDS、TEMED、APS、溴酚藍(lán)、Tris 堿、甘油、麗春紅染色劑、甘氨酸為Sigma 公司產(chǎn)品；濾紙、鹽酸、顯影液、定影液、96 孔板及其他耗材由西安醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 模型復(fù)制及處理方法 MCAO 模型復(fù)制[1-3]：10%水合氯醛以0.35 mL/100 g 腹腔注射麻醉，鉗夾大鼠的尾根部，無體動(dòng)反應(yīng)時(shí)，頸部正中部備皮，仰臥位固定，消毒。頸正中切口，鈍性分離右側(cè) CCA、ICA及ECA，暫時(shí)夾閉CCA 和ECA，在兩動(dòng)脈間剪一小切口，插入約（20.00±2.00）mm 的線栓，感到阻力時(shí)停止。固定線栓、剪除殘留線栓尾端、縫合傷口，并燈光輻射保溫。術(shù)后檢測(cè)大鼠的身體狀況。

空白組不采取措施。

假手術(shù)組除了不插入尼龍線外，其余均同模型組。

針刺組根據(jù)華興邦的動(dòng)物穴位圖譜定位，大鼠“人中”穴，0.5 寸毫針向上斜刺，并在該部位下約2 mm處毫針刺入作為參考電極，人中穴接電針儀的正極，參考電極接負(fù)極，用15 Hz，1 mA 連續(xù)波不間斷刺激20 min。

2.2 動(dòng)物模型的評(píng)價(jià) MCAO 模型排除標(biāo)準(zhǔn)：1）實(shí)驗(yàn)過程中大鼠死亡；2）斷頭取腦時(shí)，發(fā)現(xiàn)ICA 分叉處出血者。

2.3 Ang-2 RNA 的檢測(cè) 將大鼠在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)快速斷頭處死后，取出其缺血核心區(qū)腦組織，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?Trizol 提取總RNA，取 5 μL 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后取2 μL 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，GAPDH 為內(nèi)參照，熒光定量PCR 法測(cè)定Ang-2 RNA 的表達(dá)。引物及探針均由 Invitrogen 公司設(shè)計(jì)與合成。

2.4 Western 印跡法檢測(cè)Ang-2 的蛋白表達(dá) 將各時(shí)相滿足標(biāo)準(zhǔn)的所有大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，并將動(dòng)脈閉塞組織在液氮中快速冷凍并在-80 ℃下儲(chǔ)存，將樣品在冷裂解緩沖液中勻漿，提取并測(cè)定蛋白含量。根據(jù)蛋白量配制SDS-PAGE 緩沖液，95 ℃ 變性10 min，電泳分離，半干轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，用含 5%脫脂奶粉的 TBS 封閉 1 h。與兔抗大鼠 Ang-2 多克隆抗體（1:500），4 ℃ 孵育過夜，TBST 溶液洗滌 3 次后與H R P 標(biāo)記的二抗（1:5 000）室溫孵育，暗室曝光及洗片，按1:1 比例與 ECL 發(fā)光液混合，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光并成像，保留圖片。運(yùn)用Image J 軟件處理并分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶的吸光度值，將目的條帶與內(nèi)參條帶的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 中的ANOVA 分析數(shù)據(jù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Ang-2 RNA 的PCR 分析 空白組與假手術(shù)組各時(shí)相 Ang-2 RNA 表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。模型組Ang-2 RNA 表達(dá)MCAO 術(shù)后3 h 開始上調(diào)，在術(shù)后24 h時(shí)相達(dá)高峰，各時(shí)相表達(dá)均高于空白組（P＜0.05）。電針組Ang-2 RNA 表達(dá)MCAO 術(shù)后3 h 上調(diào)，在術(shù)后12 h 時(shí)相達(dá)高峰。除術(shù)后3 h 時(shí)相外，其余各時(shí)相均明顯高于同時(shí)相模型組（P＜0.05），見圖1。

圖1 電針人中穴對(duì)MCAO 大鼠腦組織Ang RNA 表達(dá)的影響

3.2 Ang-2 蛋白表達(dá)的Western 印跡分析 假手術(shù)組與空白組Ang-2 蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。模型組Ang-2 蛋白表達(dá)MCAO術(shù)后3 h開始增高，在術(shù)后24 h 時(shí)相達(dá)高峰，各時(shí)相表達(dá)均高于空白組（P＜0.05）。電針組Ang-2 蛋白表達(dá)MCAO 術(shù)后3 h呈增高趨勢(shì)，在術(shù)后12 h 時(shí)相達(dá)高峰。除術(shù)后3 h 時(shí)相外，其余各時(shí)相均明顯高于同時(shí)相模型組（P＜0.05）。見圖2、圖3。

圖2 電針人中穴對(duì)MCAO 大鼠梗死腦組織Ang-2 蛋白表達(dá)的影響

圖3 電針人中穴對(duì)MCAO 大鼠梗死腦組織Ang-2 蛋白表達(dá)的影響

4 討論

最新的腦卒中診治指南指出急性腦梗死是腦卒中最常見的類型[6]。腦梗死發(fā)生后，其始動(dòng)環(huán)節(jié)為腦缺血導(dǎo)致局部腦血流量下降，故治療的總思路為增加腦組織血流量。而改善腦循環(huán)的最佳治療時(shí)間應(yīng)在發(fā)病后2～3 d 之內(nèi)[7]。故本研究選取的時(shí)相以MCAO 后3 d 之前為主。目前腦梗死的治療方法多種多樣，以挽救缺血半暗帶區(qū)尚未完全壞死的神經(jīng)元功能，增加血流供應(yīng)為目標(biāo)[8]。藥物治療必須以良好的血流供應(yīng)為前提，才能被運(yùn)送到靶器官，在腦梗死早期腦組織絕對(duì)缺血的情況下是不可取的[9]。針刺療法不絕對(duì)依賴于血供，可通過刺激神經(jīng)傳導(dǎo)至靶器官，彌補(bǔ)了藥物治療的弊端。

“醒腦開竅”針法用于治療腦梗死由來已久，已得到了廣泛的認(rèn)可[10]。其中“人中穴”是用于急救的穴位，具有醒腦神、開清竅的作用，刺之可激發(fā)大腦神氣，就解剖位置而言，人中穴局部有面神經(jīng)及三叉神經(jīng)的分支，刺激可傳導(dǎo)至面部腦血管舒張中樞蝶腭神經(jīng)節(jié)及“三叉神經(jīng)-腦血管系統(tǒng)”，起到舒張微血管，增加腦血流量的作用[11]。有研究證實(shí)，這一作用是通過缺血半暗帶的血管新生實(shí)現(xiàn)的[12]。另外，電針作為臨床常用手段，可促進(jìn)腦組織損傷修復(fù)和舒張血管，進(jìn)一步加強(qiáng)人中穴的作用[13-14]。

前期研究表明，電針人中穴可增加梗死局部及健側(cè)的腦血流量（rCBF），縮小腦梗死體積[15-16]。而MCAO 術(shù)后大鼠rCBF、腦梗死體積的變化亦與血管新生密切相關(guān)[17]。血管新生是一個(gè)多種因子共同參與的過程，其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及其受體系統(tǒng)是整個(gè)腦缺血后血管新生調(diào)控的中心環(huán)節(jié)[18]。電針人中穴可促進(jìn) VEGF 的增殖，并使VEGF 增殖的時(shí)間提前，建立有效的側(cè)枝循環(huán)[19]。血管生成素（Ang）是一族特異性血管新生作用因子，參與內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移、基底膜分解及血管腔形成等血管生成的各個(gè)生理環(huán)節(jié)[20]。其家族有4 型，對(duì)血管新生起主要作用的有Ang-1、Ang-2[21]。Ang-2 對(duì)血管生成的影響依賴于VEGF，腦梗死發(fā)生后，隨著VEGF 的增殖，Ang-2 可松解血管壁，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng)性，協(xié)同作用促進(jìn)新的毛細(xì)血管形成[22-23]。

本研究結(jié)果表明，腦梗死早期電針人中穴可上調(diào)血管生成素-2 的基因和蛋白表達(dá)，促進(jìn)Ang-2 的增殖，并使其峰值提前，達(dá)到促進(jìn)血管新生，改善腦組織梗死區(qū)缺血半暗帶血流供應(yīng)的作用。