劉 耀，胡 蝶，程 純，劉 杰，傅 建，徐 劍*

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 550025；2.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽 550025；3.貴州省普通高等學(xué)校中藥民族藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025）

苗藥黑骨藤為蘿藦科（Asclepiadaceae）杠柳屬（Periploca）植物黑龍骨（Periploca forrestii Schltr.）的干燥根或全株[1]，具有通絡(luò)、活血、解毒、祛風(fēng)的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，黑骨藤具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用[2-6]?；瘜W(xué)成分研究表明，黑骨藤中富含黃酮、皂苷、多酚、揮發(fā)油等活性成分[7-11]。其中多酚類成分綠原酸的含量相對(duì)較高，其具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、保護(hù)心血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、降糖、免疫調(diào)節(jié)等諸多藥理活性[12-19]，具有一定的代表性。本研究采用UPLC-MS/MS 技術(shù)建立了大鼠血漿中綠原酸濃度的測(cè)定方法，研究黑骨藤不同給藥劑量下綠原酸在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程。

1 實(shí)驗(yàn)材料

ACQUITY UPLC-Xevo TQ 超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 公司）；Auw120D 型電子天平（日本島津公司）；MTN-2800D 氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；SK8210HP 超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；TGL-16B 高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），MX-S 渦旋儀（美國(guó)scilogex 公司），色譜柱ACQUITY UPLC CSH C18色譜(150 mm×3.0 mm,1.7 μm）（美國(guó)Waters 公司）。

黑骨藤飲片，購于貴州同濟(jì)堂中藥飲片有限公司；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201415，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；葛根素對(duì)照品（批號(hào)：110752-201514，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（批號(hào)：17080670，TEDIA 公司，色譜純）；乙腈（批號(hào)：17080654，TEDIA 公司，色譜純）；甲酸（批號(hào)：J259K144，德國(guó)CNW 公司，色譜純）；純凈水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；肝素鈉(批號(hào)：160228，上海藍(lán)季生物）。

18 只SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量150～180 g，購自于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證編號(hào)：SCXK（湘）2014-0011，動(dòng)物房環(huán)境：溫度18～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。

2 方法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC CSH C18（150 mm×3.0 mm,1.7 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水（0.2%甲酸）（體積比20：80）等度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣體積為2 μL。質(zhì)譜條件：采用電噴霧（ESI）離子源，毛細(xì)管電離電壓：3 kV；離子源溫度：120 ℃；去溶劑氣溫度：550 ℃；掃描方式為正離子多反應(yīng)離子檢測(cè)模式，用于定量分析監(jiān)測(cè)的離子反應(yīng)為：綠原酸m/z355.32 →163.2，葛根素m/z417.220 →297.136；錐孔電壓8 V，碰撞能量為24。

2.2 對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品適量，加甲醇濃度為165.6 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃下避光保存，臨用時(shí)取出稀釋至所需濃度。精密稱取葛根素對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成，濃度為166.8 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃下避光保存，臨用時(shí)取出稀釋至所需濃度。

2.3 給藥 取18 只SD 大鼠，隨機(jī)分為3 組，按不同劑量灌胃給予黑骨藤藥材提取物（以提取物中綠原酸含量計(jì)算，低劑量6.4 mg/kg、中劑量13.1 mg/kg、高劑量25.0 mg/kg），于給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h 經(jīng)大鼠眼眶取血，置于肝素鈉處理的EP 管中，8 000 r/min 離心15 min，取上層血漿，-20 ℃冷凍保持備用。

2.4 血漿處理 取上述血漿樣品100 μL，置于1.5 mL的EP 管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，渦旋震蕩1 min，加入400 μL 乙腈，渦旋震蕩3 min，于14 000 r/min 離心10 min，取上清液，于35 ℃下N2 吹干，用100 μL 的甲醇復(fù)溶，渦旋震蕩3 min，超聲1 min，于14 000 r/min 離心10 min，取2 μL 采用UPLC-MS/MS 進(jìn)行檢測(cè)分析。

2.5 數(shù)據(jù)處理 將采集所得到的不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血藥濃度數(shù)據(jù)采用DAS 2.0 軟件進(jìn)行分析處理，得到不同給藥劑量黑骨藤中綠原酸的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)分析，并繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性試驗(yàn) 按上述色譜條件，比較空白血漿、空白血漿加綠原酸和葛根素和給予黑骨藤提取物后大鼠血漿樣品色譜圖，結(jié)果表明大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)于綠原酸和內(nèi)標(biāo)物葛根素的測(cè)定沒有干擾，綠原酸和內(nèi)標(biāo)物葛根素的保留時(shí)間分別為3.94 min 和3.32 min，表明該方法具有良好的專屬性，結(jié)果見圖1。

圖1 血漿中綠原酸和葛根素MRM 色譜圖

3.1.2 線性范圍與定量限 取大鼠空白血漿100 μL，加入不同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL 及0.166 8 μg/mL的葛根素內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，其余按“2.4”項(xiàng)下方法配制相當(dāng)于綠原酸血漿質(zhì)量濃度分別為0.018、0.045、0.090，0.255、0.450、2.250 μg/mL 的樣品。在“2.1”條件下，進(jìn)行分析，以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)（X），以綠原酸與內(nèi)標(biāo)物葛根素的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），得回歸方程為：Y=3.422 1X-0.011 6（r=0.999 9），結(jié)果表明綠原酸在0.018～2.250 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，綠原酸最低定量限（LOD）為0.018 μg/mL。

3.1.3 精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密吸取空白血漿100 μL，加入不同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制成定量下限及高、中、低4 種濃度（18、90、450、2 250 ng/mL）的質(zhì)控樣品，每種濃度各5 份樣本，按“2.4”項(xiàng)下進(jìn)行操作，按“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)測(cè)定3 d，將峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。對(duì)比實(shí)測(cè)與已知樣品濃度，計(jì)算綠原酸的日內(nèi)、日間精密度（RSD）及準(zhǔn)確度，結(jié)果表明，該方法的精密度和準(zhǔn)確度符合生物樣品定量分析方法要求，結(jié)果見表1。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取空白血漿100 μL，加入不同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制備成高、中、低3種濃度（90、450、2250 ng/mL）的質(zhì)控樣品，每種濃度各5 份樣本，按“2.4”項(xiàng)下進(jìn)行操作，分別考察25 ℃放置24 h，-80 ℃反復(fù)凍融3 次的穩(wěn)定性。結(jié)果表明樣品放置于不同的溫度下穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表2。

3.1.5 基質(zhì)效應(yīng)與回收率試驗(yàn) 精密吸取空白血漿100 μL，加入不同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制成高、中、低3 種不同濃度（90、450、2 250 ng/mL）的質(zhì)控樣品，每種濃度各6 份樣本，按“2.4”項(xiàng)下進(jìn)行操作，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，計(jì)算綠原酸與內(nèi)標(biāo)物葛根素峰面積的比值為A；另取空白血漿100 μL，按“2.4”項(xiàng)下不加入內(nèi)標(biāo)溶液操作至乙腈沉淀蛋白，吸取上清液，向其中加入上述相應(yīng)濃度的綠原酸與葛根素混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，計(jì)算其峰面積之比為B；取上述相應(yīng)濃度的綠原酸及葛根素混合對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，計(jì)算其峰面積之比為C。其中基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%，回收率=A/C×100%。結(jié)果表明，綠原酸的提取回收率88.76%～113.28%，RSD 小于4.68%；綠原酸基質(zhì)效應(yīng)范圍為88.01%～99.83%，RSD 小于7.97%，符合生物樣品定量分析方法要求，結(jié)果見表3。

表1 UPLC-MS/MS 法測(cè)定黑骨藤中綠原酸的精密度與準(zhǔn)確度

表2 UPLC-MS/MS 法測(cè)定黑骨藤中綠原酸穩(wěn)定性考察結(jié)果

表3 大鼠血漿中綠原酸提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)（n=6）

3.1.6 殘留考察 在進(jìn)樣定量上限綠原酸對(duì)照品后進(jìn)樣空白血漿樣品，結(jié)果空白血漿樣品中未顯示任何顯著的峰（≥20%的綠原酸對(duì)照品和5%的內(nèi)標(biāo)），且本研究采用等度洗脫結(jié)束后平衡1 min，加上儀器自帶的洗針系統(tǒng)，可以有效的避免了樣品殘留問題。

3.2 藥動(dòng)學(xué)研究 采用DAS 2.0 軟件對(duì)大鼠給藥后的不同時(shí)間血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行房室模型擬合，發(fā)現(xiàn)不同給藥劑量黑骨藤中綠原酸在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程均與一室房室模型符合較好，擬合后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表4，藥-時(shí)曲線見圖2。

表4 不同給藥劑量綠原酸大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n=6）

表4 不同給藥劑量綠原酸大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n=6）

圖2 不同給藥劑量綠原酸大鼠藥-時(shí)曲線

4 討論

4.1 測(cè)定方法 本試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS 法，對(duì)大鼠血漿中的綠原酸進(jìn)行測(cè)定，較傳統(tǒng)的HPLC 法，具有快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，僅需5 min 即可完成大鼠血漿樣品的分析，并采用MRM 模式可快速篩查出血漿樣品中的目標(biāo)成分，具有極高的靈敏度與專屬性。

4.2 內(nèi)標(biāo)的選擇 葛根素與綠原酸結(jié)構(gòu)相似，均具有多個(gè)苯環(huán)及酚羥基，在測(cè)定的色譜條件下進(jìn)行分析，葛根素保留時(shí)間適宜，與目標(biāo)成分綠原酸完全分離，峰型良好，且血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)檢測(cè)沒有干擾，故選擇葛根素為綠原酸血漿樣品測(cè)定的內(nèi)標(biāo)。

4.3 黑骨藤中綠原酸在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為 大鼠口服給予黑骨藤后，對(duì)高、中、低不同劑量所獲得的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax 及AUC0-t 與給藥劑量進(jìn)行一元線性回歸分析，分別得到回歸方程為：Y=0.031 3X-0.029 9（r=0.999），Y=0.119 1X-0.047 89（r=0.988），表明在6.4～25 mg/kg 劑量范圍內(nèi)，黑骨藤中綠原酸在大鼠體內(nèi)表現(xiàn)為線性動(dòng)力學(xué)特征，各劑量下綠原酸達(dá)峰時(shí)間（Tmax）均為1.5 h。較文獻(xiàn)對(duì)比[20-22]，黑骨藤中綠原酸的吸收出現(xiàn)滯后現(xiàn)象，不同劑量給藥后Tlag分別為0.450、0.466、0.425 h，提示黑骨藤中其他化學(xué)成分可能會(huì)對(duì)綠原酸的吸收產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制作用。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，低劑量組與中、高劑量組結(jié)果有顯著差異（P＜0.05），結(jié)果提示不同給藥劑量對(duì)大鼠體內(nèi)綠原酸的消除速度有一定影響，隨著劑量的遞增，消除速度逐漸減小，當(dāng)達(dá)到一定劑量后趨于平衡。

綜上所述，本試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS 法建立了一種快速、準(zhǔn)確、高靈敏度的大鼠血漿中綠原酸含量分析方法。并將其應(yīng)用于黑骨藤中綠原酸在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究，結(jié)果可為苗藥黑骨藤的藥物研發(fā)和臨床合理用藥提供了一定理論依據(jù)。