崔發(fā)財，陳瑜，胡敏，毋小玉，魏曉霞

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是一種常見的消化道惡性腫瘤，在我國患病率和死亡率分別居于第三位和第五位[1]，盡管近年來在診斷和治療技術(shù)上取得了較好的進展，但進展期結(jié)直腸癌尤其伴發(fā)遠端轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后仍然較差[2]。中心體相關(guān)激酶2（NIMA-related kinase 2,NEK2）是一種周期性表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)控多種細胞周期相關(guān)蛋白活性，也是中心體的重要組成部分，對維持有絲分裂進展和雙極紡錘體的正確形成發(fā)揮重要的調(diào)控作用，它還與細胞中心體上的微管相結(jié)合促進G2/M期細胞中心體分離。研究發(fā)現(xiàn)NEK2異?；罨瘜?dǎo)致中心體的復(fù)制失敗和不成熟的中心粒分離，出現(xiàn)染色體不穩(wěn)定和非整倍體，從而參與了癌癥的起始過程。目前已經(jīng)在胃癌[3]、小細胞肺癌[4]、前列腺癌[5]等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)NEK2表達上調(diào)并促進腫瘤細胞增殖及侵襲，然而NEK2的表達水平與結(jié)直腸癌的關(guān)系目前還鮮有報道，本研究旨在探明NEK2在結(jié)直腸癌組織中的表達水平及其與臨床病理特征的關(guān)系，研究沉默NEK2對結(jié)直腸癌細胞HCT116增殖及侵襲遷移能力的影響及可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 收集2016年1月—12月在河南省人民醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治術(shù)的100例患者的癌組織及癌旁組織（距癌灶邊緣>5 cm取材），其中男68例、女32例，中位年齡59歲（24～76歲）。所有患者術(shù)前均未接受放化療，術(shù)后病理結(jié)果均經(jīng)2名以上病理醫(yī)師確認，且都有完整的臨床病例資料，本研究遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

1.1.2 細胞株及主要試劑 人結(jié)直腸癌細胞株HCT116、SW480、SW620和人正常結(jié)直腸黏膜細胞FHC均保存于河南省人民醫(yī)院中心實驗室。胎牛血清（FBS）、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶及流式細胞術(shù)單染試劑碘化丙錠（PI）購自美國Gibco公司；RNA提取液、qRT-PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成；免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色液、兔抗人多克隆抗體NEK2（PAH562）、E-cadherin（PAB290）、N-cadherin（PAE582）、CDK4（PAC045）及兔抗人單克隆抗體cyclin D1（PAB021）均購自武漢云克隆科技股份有限公司；CCK8試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；Transwell小室（孔徑3.0 μm）購自美國Corning公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測結(jié)直腸癌組織中NEK2表達 結(jié)直腸癌組織石蠟塊以4 μm連續(xù)切片，S-ABC法染色；二甲苯脫蠟，乙醇水化后行抗原修復(fù)，4%H2O2阻斷10 min，5%BSA于37℃封閉1 h，滴加兔抗人多克隆抗體（1:100）4℃過夜。生物素化二抗（1:500）孵育1 h后加入新鮮配置的DAB液顯色，蘇木精對比染色后樹膠封片，觀察染色情況。結(jié)果判定參照文獻報道[6]，采用5點評分系統(tǒng)評價陽性細胞數(shù)：無陽性細胞數(shù)為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；采用4點評分系統(tǒng)評價細胞染色強度：無染色（-）為0分，染色弱為（+）為1分，染色呈棕黃色（++）為2分，呈深棕色（+++）為3分。兩項計分的乘積為免疫反應(yīng)性分數(shù)（immunoreactivity scores,IRSs），IRSs≤4為NEK2蛋白低表達，>4為NEK2蛋白高表達。

1.2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測NEK2基因在不同結(jié)直腸癌細胞系中的表達水平 以細胞生長融合度達80%～90%時收集細胞，根據(jù)TRIzol操作說明書提取細胞總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒操作說明書進行PCR定量反應(yīng)。引物序列分別為：NEK2正義鏈為5'-TGCTTCGTGAACTGAAACATCC-3'，反義鏈為5'-CCAGAGTCAACTGAGTCATCACT-3'；GAPDH正義鏈為5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反義鏈為5'-GGCTGTTGTCATAC TTCTCATGG-3'。PCR反應(yīng)條件如下，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為42℃ 60 min，70℃ 10 min，冰上降溫，PCR預(yù)變性95℃ 10 min，然后95℃ 15 s、60℃ 60 s、每20 s升溫1℃，共40次循環(huán)。根據(jù)目的基因NEK2和內(nèi)參基因GAPDH測得CT值差異，運用2-ΔΔCt（RQ）法計算NEK2的相對表達量，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 細胞分組與轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的HCT116細胞，以2×105個/孔接種至6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。待細胞達到70%～80%融合時，按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體試劑盒說明書轉(zhuǎn)染細胞，實驗細胞分為陽性轉(zhuǎn)染組（si-NEK2）、陰性對照組（si-CTRL）和空白組。NEK2 siRNA干擾正義鏈：5'-GCUUGUUUCUGAAGUGAAUTT-3'；CTRL siRNA干擾正義鏈：5'-AAGTAGCCGAGCTTCGATTGC-3'，均由吉瑪基因合成。

1.2.4 免疫印跡法檢測敲低NEK2對HCT116細胞NEK2、E-cadherin、N-cadherin、CDK4及cyclin D1蛋白表達的影響 收集細胞并用細胞裂解液裂解提取細胞總蛋白，取50 μg蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，1%BSA封閉過夜，分別加入NEK2（1:500）、N-cadherin（1:500）、E-cadherin（1:500）、CDK4（1:200）、cyclin D1（1:400）及GAPDH（1:1 000）一抗37℃孵育2 h，TBST漂洗后，加入1:1 000稀釋的羊抗兔二抗37℃孵育1 h，將PVDF膜浸于1 ml顯色液中避光約10 min后觀察結(jié)果，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的相對分子質(zhì)量和凈吸光度值。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 CCK8法檢測敲低NEK2對HCT116細胞增殖能力的影響 將100 μl密度為每毫升5×104個細胞的懸液加入96孔板中，細胞貼壁后加入CCK8試劑，分別在24、48、72 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度（OD）值，代表細胞增殖水平。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 流式細胞學(xué)檢測敲低NEK2對HCT116細胞周期分布的影響 細胞按照每毫升5×105個接種于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，細胞融合度達到80%時轉(zhuǎn)染細胞并繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化并收集細胞，2 500 r/min離心5 min取細胞沉淀，PBS洗滌兩次，細胞經(jīng)預(yù)冷的70%乙醇4℃固定18 h，離心棄固定液，PBS洗滌3次，調(diào)整細胞濃度為每毫升1×106，取1 ml細胞懸液，與含20 μg/ml RΝA酶的Tris-HCL緩沖液37oC孵育30 min，用50 μg/ml碘化丙錠（PI）進行細胞DNA染色。樣品用Beckman counter公司FC500MCL/MPL流式細胞儀測細胞周期，采用Multicycle for windows數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell小室法檢測敲低NEK2對HCT116細胞侵襲能力的影響 紫外線照射消毒8 μm膜孔Transwell板，下室加入含趨化因子的細胞培養(yǎng)液，各實驗組細胞以5×104/ml接種于含人工基底膜成份的Transwell小室并套入下室，37℃培養(yǎng)箱孵育24 h。取出上室，吸取殘液。在下室中添加70%甲醛固定30 min，常規(guī)結(jié)晶紫染色，在高倍鏡視野下計數(shù)小室面細胞數(shù)即為穿透細胞數(shù)。

1.2.8 細胞劃痕實驗檢測敲低NEK2對HCT116細胞遷移能力的影響 各實驗組細胞胰酶消化后以5×105個/毫升接種于6孔板中，待細胞融合度達到100%時用10 μl移液器槍頭在培養(yǎng)孔底部劃痕，空白組作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后顯微鏡下觀察細胞遷移距離并拍照，測量多個點劃痕寬度，計算平均劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（x±s）表示，多組間均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。采用秩和檢驗分析NEK2表達水平與臨床病理特征的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NEK2蛋白在CRC組織中的表達及其與CRC臨床病理特征的關(guān)系

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示NEK2蛋白主要定位于腫瘤細胞胞質(zhì)，少部分定位于胞核內(nèi)，染色呈棕黃色和深黃色，而在癌旁組織中不表達或弱陽性表達于正常黏膜細胞胞質(zhì)內(nèi)，見圖1；根據(jù)免疫組織化學(xué)評分標(biāo)準，NEK2蛋白在癌組織中陽性表達率為65%（65/100），明顯高于癌旁組織38%（38/100），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14.593,P<0.01）；結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEK2表達與結(jié)直腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（均P<0.05），而與性別、年齡、腫瘤直徑大小及腫瘤分化程度無顯著相關(guān)（均P>0.05），見表 1。

2.2 NEK2 mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌細胞中表達高于正常對照細胞

圖1 NEK2蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達 (免疫組織化學(xué) ×200)Figure 1 Expression of NEK2 protein in colorectal cancer and adjacent normal tissues (IHC ×200)

表1 NEK2表達水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table1 Relation between NEK2 expression and clinicopathological characteristics of colorectal cancer(CRC) patients

qRT-PCR結(jié)果顯示NEK2 mRNA在結(jié)直腸癌細胞SW480、SW620和HCT116中的表達含量明顯高于正常結(jié)直腸黏膜細胞FHC（均P<0.01），以低分化HCT116細胞表達含量最高，見圖2A；Western blot結(jié)果顯示，NEK2蛋白在結(jié)直腸癌細胞SW480（3.78±0.17）、SW620（2.62±0.36）和HCT116（4.35±0.18）中的表達含量明顯高于正常結(jié)直腸黏膜細胞FHC（均P<0.01），以低分化HCT116細胞表達含量最高，見圖2B。

2.3 NEK2 siRNA可顯著降低HCT116細胞中NEK2 mRNA及蛋白表達量

si-NEK2及si-CTRL轉(zhuǎn)染細胞后，陽性轉(zhuǎn)染（si-NEK2 HCT116）組的NEK2 mRNA表達水平（0.28±0.07）顯著低于陰性對照（si-CTRL HCT116）組（1.03±0.14）及空白（HCT116）組（均P<0.01），陽性干擾組NEK2蛋白相對表達含量（0.18±0.07）顯著低于陰性對照組（1.03±0.14）及空白組（均P<0.01），見圖3，陰性對照組與空白組間NEK2 mRNA及蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 敲低NEK2后結(jié)直腸癌細胞增殖能力顯著下降

CCK8檢測結(jié)果顯示細胞轉(zhuǎn)染24～72 h后，陽性轉(zhuǎn)染組細胞HCT116的增殖能力較陰性對照組和空白組明顯下降（均P<0.01），而空白組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05），表明干擾NEK2表達可顯著抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖能力，見圖4。

圖2 NEK2 mRNA(A)和蛋白(B,C)在結(jié)直腸癌細胞中的表達Figure 2 Expression of NEK2 mRNA(A) and protein(B,C)in CRC cells

圖3 轉(zhuǎn)染si-NEK2或si-CTRL的HCT116細胞中NEK2蛋白表達Figure 3 Expression of NEK2 protein in HCT116 cells transfected with si-NEK2 or si-CTRL

圖4 敲低NEK2對結(jié)直腸癌細胞HCT116增殖能力的影響Figure 4 Effects of NEK2 knockdown on proliferation capability of HCT116 cells

2.5 敲低NEK2后結(jié)直腸癌細胞發(fā)生G0/G1期周期阻滯

流式細胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白組相比，陽性對照組G0/G1期細胞比例升高，S期比例下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01），而陰性對照組和空白組間的細胞周期比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖5。

2.6 敲低NEK2后結(jié)直腸癌細胞的侵襲和遷移能力顯著下降

Transwell小室法檢測結(jié)果顯示，陽性轉(zhuǎn)染組的穿膜細胞數(shù)明顯低于陰性對照組和空白組（（95.67±7.77）vs.（163.00±13.08）、（171.33±13.05），均P<0.01），陰性對照組和空白組間穿膜細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖6A、B；劃痕實驗結(jié)果顯示，陽性轉(zhuǎn)染組的劃痕愈合率明顯低于陰性對照組和空白組（（31.80±4.10）%vs.（70.57±2.32）%、（72.77±3.25）%，均P<0.01），陰性對照組和空白組間劃痕愈合率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），圖6C、D。

2.7 敲低NEK2后結(jié)直腸癌細胞E-cadherin、N-cadherin、CDK4和cyclin D1的表達情況

Western blot檢測結(jié)果顯示，對比陰性對照組和空白組，細胞周期相關(guān)蛋白CDK4和cyclin D1，EMT相關(guān)分子標(biāo)志物N-cadherin在陽性對照組的表達量顯著下降（P<0.01），EMT相關(guān)分子標(biāo)志物E-cadherin在陽性對照組的表達量顯著升高（P<0.01）。上述蛋白在陰性對照組和空白組間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖7。

圖5 敲低NEK2對結(jié)直腸癌細胞HCT116周期的影響Figure 5 Effects of NEK2 knockdown on cell cycle of colorectal cancer HCT116 cells

圖6 敲低NEK2對結(jié)直腸癌細胞HCT116侵襲(A,B)和遷移(C,D)能力的影響Figure 6 Effects of NEK knockdown on invasion(A,B) and migration(C,D) abilities of colorectal cancer HCT116 cells

圖7 細胞周期蛋白CDK4和cyclin D1(A,B)，EMT相關(guān)分子標(biāo)志物E-cadherin和N-cadherin(C,D)在結(jié)直腸癌細胞HCT116中的表達Figure 7 Expression of CDK4 and cyclin D1(A,B),E-cadherin and N-cadheri n(C,D) in colorectal cancer HCT116 cells

3 討論

NEK2基因定位于染色體1q32.2～1q41，其表達蛋白是一種與中心體（never in mitosis A，NIMA）有絲分裂調(diào)節(jié)器結(jié)構(gòu)相似的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它包含一個N端的催化激酶結(jié)構(gòu)域，C端結(jié)構(gòu)域包含亮氨酸拉鏈、卷曲螺旋、中心體結(jié)合位點、核仁定位和微管結(jié)合位點、PP1結(jié)合位點和APC結(jié)合位點等多種結(jié)構(gòu)基團[7]，NEK2通過結(jié)合并磷酸化有絲分裂相關(guān)蛋白參與染色體的復(fù)制和分離[8]、微管穩(wěn)定[9]、著絲點附著和紡錘體組裝等細胞周期過程[10-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NEK2異?；罨瘯?dǎo)致染色體不穩(wěn)定和染色體包含異常內(nèi)容，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[12]。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)NEK2在肝細胞癌中的表達水平與患者的預(yù)后呈負相關(guān)，NEK2通過激活Wnt、ΝF-κB、VEGF及P53信號通路介導(dǎo)EMT機制促進了肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，另有研究表明NEK2可通過活化蛋白激酶磷酸酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信號通路調(diào)控HepG2細胞的增殖、凋亡及其他生物學(xué)行為[14]。在前列腺癌的研究中，Zeng等[15]發(fā)現(xiàn)NEK2在人前列腺癌細胞和原發(fā)性前列腺癌組織中表達升高并與患者的Gleason評分及病理分期呈正相關(guān)，通過siRNA技術(shù)沉默NEK2表達可抑制前列腺癌細胞的體外增殖和異種移植體的體內(nèi)生長。此外，Kokuryo等[16]也發(fā)現(xiàn)NEK2在胰腺癌細胞株中高表達，NEK2 siRNA可抑制胰腺癌皮下移植瘤小鼠模型的腫瘤生長，延長腹腔內(nèi)移植瘤小鼠模型的生存時間，并利用門靜脈導(dǎo)管系統(tǒng)有效地阻止肝轉(zhuǎn)移的進展。以上結(jié)果表明，NEK2的異常表達促進了腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，而針對NEK2的siRNA治療有可能作為腫瘤治療的一個有效手段。

本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)、qRT-PCR和Western blot檢測NEK2在結(jié)直腸癌組織及細胞中的表達，結(jié)果顯示NEK2蛋白及mRNA在結(jié)直腸癌組織及細胞中高表達，并與結(jié)直腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示NEK2可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。為探究NEK2在結(jié)直腸癌中的作用機制，我們選取結(jié)直腸癌細胞HCT116作為研究對象，通過體外瞬時轉(zhuǎn)染NEK2 siRNA抑制HCT116中NEK2 mRNA表達。CCK8實驗及流式細胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，NEK2干擾后，HCT116細胞G1期比例增加，S期比例減低，提示出現(xiàn)G0/G1期阻滯，并且細胞增殖率較對照組顯著下降。CDK4是細胞G1/S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控因子，它與細胞cyclin D1形成復(fù)合物后可使視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白發(fā)生磷酸化失活，驅(qū)動細胞周期進展[17]，目前在乳腺癌研究中已發(fā)現(xiàn)NEK2與CDK4的表達存在分子連接性[18]。NEK2是否通過與CDK4和cyclin D1的相互作用參與結(jié)直腸癌細胞的周期調(diào)控，本研究結(jié)果顯示在NEK2干擾陽性轉(zhuǎn)染組中CDK4和cyclin D1的表達量顯著降低，表明NEK2下調(diào)可通過改變CDK4和cyclin D1表達量使結(jié)直腸癌細胞發(fā)生周期阻滯，抑制細胞生長。此外Transwell小室法和劃痕實驗的檢測結(jié)果顯示，NEK2干擾后HCT116細胞穿膜細胞數(shù)及劃痕愈合率均顯著下降，表明NEK2下調(diào)能顯著降低HCT116細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。高度保守的Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)控胚胎發(fā)育、器官形成、組織再生及決定細胞命運方面發(fā)揮著重要作用，而多種腫瘤癌基因則通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路使其異?；罨龠M結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[19-21]。在肝細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)NEK2的異?；罨筛淖儲?catenin在細胞內(nèi)定位，進而促進腫瘤細胞EMT進程并獲得侵襲性表型[22]。為研究結(jié)直腸癌中NEK2表達與EMT機制的關(guān)系，本研究通過Western blot檢測EMT關(guān)鍵組件E-cadherin和N-cadherin在HCT116細胞中的變化，結(jié)果顯示敲低NEK2后HCT116細胞E-cadherin蛋白高表達，N-cadherin低表達，表明NEK2在EMT過程中及結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤促進功能上發(fā)揮著關(guān)鍵作用，然而NEK2具體通過何種信號通路參與調(diào)控EMT進程仍有待進一步的研究。

本研究結(jié)果表明，NEK2在結(jié)直腸癌組織中高表達，下調(diào)NEK2表達可抑制人結(jié)直腸癌細胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，提示NEK2在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，可作為結(jié)直腸癌基因治療的有效靶點。