崔發(fā)財(cái)，陳瑜，胡敏，毋小玉，魏曉霞

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在我國(guó)患病率和死亡率分別居于第三位和第五位[1]，盡管近年來(lái)在診斷和治療技術(shù)上取得了較好的進(jìn)展，但進(jìn)展期結(jié)直腸癌尤其伴發(fā)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后仍然較差[2]。中心體相關(guān)激酶2（NIMA-related kinase 2,NEK2）是一種周期性表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)控多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白活性，也是中心體的重要組成部分，對(duì)維持有絲分裂進(jìn)展和雙極紡錘體的正確形成發(fā)揮重要的調(diào)控作用，它還與細(xì)胞中心體上的微管相結(jié)合促進(jìn)G2/M期細(xì)胞中心體分離。研究發(fā)現(xiàn)NEK2異?；罨瘜?dǎo)致中心體的復(fù)制失敗和不成熟的中心粒分離，出現(xiàn)染色體不穩(wěn)定和非整倍體，從而參與了癌癥的起始過(guò)程。目前已經(jīng)在胃癌[3]、小細(xì)胞肺癌[4]、前列腺癌[5]等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)NEK2表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲，然而NEK2的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的關(guān)系目前還鮮有報(bào)道，本研究旨在探明NEK2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系，研究沉默NEK2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116增殖及侵襲遷移能力的影響及可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 收集2016年1月—12月在河南省人民醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治術(shù)的100例患者的癌組織及癌旁組織（距癌灶邊緣>5 cm取材），其中男68例、女32例，中位年齡59歲（24～76歲）。所有患者術(shù)前均未接受放化療，術(shù)后病理結(jié)果均經(jīng)2名以上病理醫(yī)師確認(rèn)，且都有完整的臨床病例資料，本研究遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

1.1.2 細(xì)胞株及主要試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480、SW620和人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC均保存于河南省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。胎牛血清（FBS）、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶及流式細(xì)胞術(shù)單染試劑碘化丙錠（PI）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNA提取液、qRT-PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成；免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色液、兔抗人多克隆抗體NEK2（PAH562）、E-cadherin（PAB290）、N-cadherin（PAE582）、CDK4（PAC045）及兔抗人單克隆抗體cyclin D1（PAB021）均購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司；CCK8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Transwell小室（孔徑3.0 μm）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中NEK2表達(dá) 結(jié)直腸癌組織石蠟塊以4 μm連續(xù)切片，S-ABC法染色；二甲苯脫蠟，乙醇水化后行抗原修復(fù)，4%H2O2阻斷10 min，5%BSA于37℃封閉1 h，滴加兔抗人多克隆抗體（1:100）4℃過(guò)夜。生物素化二抗（1:500）孵育1 h后加入新鮮配置的DAB液顯色，蘇木精對(duì)比染色后樹(shù)膠封片，觀察染色情況。結(jié)果判定參照文獻(xiàn)報(bào)道[6]，采用5點(diǎn)評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；采用4點(diǎn)評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)細(xì)胞染色強(qiáng)度：無(wú)染色（-）為0分，染色弱為（+）為1分，染色呈棕黃色（++）為2分，呈深棕色（+++）為3分。兩項(xiàng)計(jì)分的乘積為免疫反應(yīng)性分?jǐn)?shù)（immunoreactivity scores,IRSs），IRSs≤4為NEK2蛋白低表達(dá)，>4為NEK2蛋白高表達(dá)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)NEK2基因在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平 以細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)80%～90%時(shí)收集細(xì)胞，根據(jù)TRIzol操作說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR定量反應(yīng)。引物序列分別為：NEK2正義鏈為5'-TGCTTCGTGAACTGAAACATCC-3'，反義鏈為5'-CCAGAGTCAACTGAGTCATCACT-3'；GAPDH正義鏈為5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反義鏈為5'-GGCTGTTGTCATAC TTCTCATGG-3'。PCR反應(yīng)條件如下，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為42℃ 60 min，70℃ 10 min，冰上降溫，PCR預(yù)變性95℃ 10 min，然后95℃ 15 s、60℃ 60 s、每20 s升溫1℃，共40次循環(huán)。根據(jù)目的基因NEK2和內(nèi)參基因GAPDH測(cè)得CT值差異，運(yùn)用2-ΔΔCt（RQ）法計(jì)算NEK2的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種至6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體試劑盒說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組（si-NEK2）、陰性對(duì)照組（si-CTRL）和空白組。NEK2 siRNA干擾正義鏈：5'-GCUUGUUUCUGAAGUGAAUTT-3'；CTRL siRNA干擾正義鏈：5'-AAGTAGCCGAGCTTCGATTGC-3'，均由吉瑪基因合成。

1.2.4 免疫印跡法檢測(cè)敲低NEK2對(duì)HCT116細(xì)胞NEK2、E-cadherin、N-cadherin、CDK4及cyclin D1蛋白表達(dá)的影響 收集細(xì)胞并用細(xì)胞裂解液裂解提取細(xì)胞總蛋白，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，1%BSA封閉過(guò)夜，分別加入NEK2（1:500）、N-cadherin（1:500）、E-cadherin（1:500）、CDK4（1:200）、cyclin D1（1:400）及GAPDH（1:1 000）一抗37℃孵育2 h，TBST漂洗后，加入1:1 000稀釋的羊抗兔二抗37℃孵育1 h，將PVDF膜浸于1 ml顯色液中避光約10 min后觀察結(jié)果，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的相對(duì)分子質(zhì)量和凈吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 CCK8法檢測(cè)敲低NEK2對(duì)HCT116細(xì)胞增殖能力的影響 將100 μl密度為每毫升5×104個(gè)細(xì)胞的懸液加入96孔板中，細(xì)胞貼壁后加入CCK8試劑，分別在24、48、72 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度（OD）值，代表細(xì)胞增殖水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)敲低NEK2對(duì)HCT116細(xì)胞周期分布的影響 細(xì)胞按照每毫升5×105個(gè)接種于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化并收集細(xì)胞，2 500 r/min離心5 min取細(xì)胞沉淀，PBS洗滌兩次，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的70%乙醇4℃固定18 h，離心棄固定液，PBS洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×106，取1 ml細(xì)胞懸液，與含20 μg/ml RΝA酶的Tris-HCL緩沖液37oC孵育30 min，用50 μg/ml碘化丙錠（PI）進(jìn)行細(xì)胞DNA染色。樣品用Beckman counter公司FC500MCL/MPL流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期，采用Multicycle for windows數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell小室法檢測(cè)敲低NEK2對(duì)HCT116細(xì)胞侵襲能力的影響 紫外線照射消毒8 μm膜孔Transwell板，下室加入含趨化因子的細(xì)胞培養(yǎng)液，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以5×104/ml接種于含人工基底膜成份的Transwell小室并套入下室，37℃培養(yǎng)箱孵育24 h。取出上室，吸取殘液。在下室中添加70%甲醛固定30 min，常規(guī)結(jié)晶紫染色，在高倍鏡視野下計(jì)數(shù)小室面細(xì)胞數(shù)即為穿透細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低NEK2對(duì)HCT116細(xì)胞遷移能力的影響 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化后以5×105個(gè)/毫升接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)用10 μl移液器槍頭在培養(yǎng)孔底部劃痕，空白組作為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移距離并拍照，測(cè)量多個(gè)點(diǎn)劃痕寬度，計(jì)算平均劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。采用秩和檢驗(yàn)分析NEK2表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NEK2蛋白在CRC組織中的表達(dá)及其與CRC臨床病理特征的關(guān)系

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示NEK2蛋白主要定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，少部分定位于胞核內(nèi)，染色呈棕黃色和深黃色，而在癌旁組織中不表達(dá)或弱陽(yáng)性表達(dá)于正常黏膜細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，見(jiàn)圖1；根據(jù)免疫組織化學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，NEK2蛋白在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為65%（65/100），明顯高于癌旁組織38%（38/100），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.593,P<0.01）；結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEK2表達(dá)與結(jié)直腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（均P<0.05），而與性別、年齡、腫瘤直徑大小及腫瘤分化程度無(wú)顯著相關(guān)（均P>0.05），見(jiàn)表 1。

2.2 NEK2 mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)高于正常對(duì)照細(xì)胞

圖1 NEK2蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá) (免疫組織化學(xué) ×200)Figure 1 Expression of NEK2 protein in colorectal cancer and adjacent normal tissues (IHC ×200)

表1 NEK2表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table1 Relation between NEK2 expression and clinicopathological characteristics of colorectal cancer(CRC) patients

qRT-PCR結(jié)果顯示NEK2 mRNA在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、SW620和HCT116中的表達(dá)含量明顯高于正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC（均P<0.01），以低分化HCT116細(xì)胞表達(dá)含量最高，見(jiàn)圖2A；Western blot結(jié)果顯示，NEK2蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480（3.78±0.17）、SW620（2.62±0.36）和HCT116（4.35±0.18）中的表達(dá)含量明顯高于正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC（均P<0.01），以低分化HCT116細(xì)胞表達(dá)含量最高，見(jiàn)圖2B。

2.3 NEK2 siRNA可顯著降低HCT116細(xì)胞中NEK2 mRNA及蛋白表達(dá)量

si-NEK2及si-CTRL轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染（si-NEK2 HCT116）組的NEK2 mRNA表達(dá)水平（0.28±0.07）顯著低于陰性對(duì)照（si-CTRL HCT116）組（1.03±0.14）及空白（HCT116）組（均P<0.01），陽(yáng)性干擾組NEK2蛋白相對(duì)表達(dá)含量（0.18±0.07）顯著低于陰性對(duì)照組（1.03±0.14）及空白組（均P<0.01），見(jiàn)圖3，陰性對(duì)照組與空白組間NEK2 mRNA及蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 敲低NEK2后結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力顯著下降

CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)染24～72 h后，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞HCT116的增殖能力較陰性對(duì)照組和空白組明顯下降（均P<0.01），而空白組與陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），表明干擾NEK2表達(dá)可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力，見(jiàn)圖4。

圖2 NEK2 mRNA(A)和蛋白(B,C)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2 Expression of NEK2 mRNA(A) and protein(B,C)in CRC cells

圖3 轉(zhuǎn)染si-NEK2或si-CTRL的HCT116細(xì)胞中NEK2蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of NEK2 protein in HCT116 cells transfected with si-NEK2 or si-CTRL

圖4 敲低NEK2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116增殖能力的影響Figure 4 Effects of NEK2 knockdown on proliferation capability of HCT116 cells

2.5 敲低NEK2后結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期周期阻滯

流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白組相比，陽(yáng)性對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期比例下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），而陰性對(duì)照組和空白組間的細(xì)胞周期比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖5。

2.6 敲低NEK2后結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著下降

Transwell小室法檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于陰性對(duì)照組和空白組（（95.67±7.77）vs.（163.00±13.08）、（171.33±13.05），均P<0.01），陰性對(duì)照組和空白組間穿膜細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖6A、B；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組的劃痕愈合率明顯低于陰性對(duì)照組和空白組（（31.80±4.10）%vs.（70.57±2.32）%、（72.77±3.25）%，均P<0.01），陰性對(duì)照組和空白組間劃痕愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），圖6C、D。

2.7 敲低NEK2后結(jié)直腸癌細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、CDK4和cyclin D1的表達(dá)情況

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)比陰性對(duì)照組和空白組，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4和cyclin D1，EMT相關(guān)分子標(biāo)志物N-cadherin在陽(yáng)性對(duì)照組的表達(dá)量顯著下降（P<0.01），EMT相關(guān)分子標(biāo)志物E-cadherin在陽(yáng)性對(duì)照組的表達(dá)量顯著升高（P<0.01）。上述蛋白在陰性對(duì)照組和空白組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖7。

圖5 敲低NEK2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116周期的影響Figure 5 Effects of NEK2 knockdown on cell cycle of colorectal cancer HCT116 cells

圖6 敲低NEK2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116侵襲(A,B)和遷移(C,D)能力的影響Figure 6 Effects of NEK knockdown on invasion(A,B) and migration(C,D) abilities of colorectal cancer HCT116 cells

圖7 細(xì)胞周期蛋白CDK4和cyclin D1(A,B)，EMT相關(guān)分子標(biāo)志物E-cadherin和N-cadherin(C,D)在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116中的表達(dá)Figure 7 Expression of CDK4 and cyclin D1(A,B),E-cadherin and N-cadheri n(C,D) in colorectal cancer HCT116 cells

3 討論

NEK2基因定位于染色體1q32.2～1q41，其表達(dá)蛋白是一種與中心體（never in mitosis A，NIMA）有絲分裂調(diào)節(jié)器結(jié)構(gòu)相似的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它包含一個(gè)N端的催化激酶結(jié)構(gòu)域，C端結(jié)構(gòu)域包含亮氨酸拉鏈、卷曲螺旋、中心體結(jié)合位點(diǎn)、核仁定位和微管結(jié)合位點(diǎn)、PP1結(jié)合位點(diǎn)和APC結(jié)合位點(diǎn)等多種結(jié)構(gòu)基團(tuán)[7]，NEK2通過(guò)結(jié)合并磷酸化有絲分裂相關(guān)蛋白參與染色體的復(fù)制和分離[8]、微管穩(wěn)定[9]、著絲點(diǎn)附著和紡錘體組裝等細(xì)胞周期過(guò)程[10-11]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，NEK2異常活化會(huì)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定和染色體包含異常內(nèi)容，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[12]。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)NEK2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，NEK2通過(guò)激活Wnt、ΝF-κB、VEGF及P53信號(hào)通路介導(dǎo)EMT機(jī)制促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，另有研究表明NEK2可通過(guò)活化蛋白激酶磷酸酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信號(hào)通路調(diào)控HepG2細(xì)胞的增殖、凋亡及其他生物學(xué)行為[14]。在前列腺癌的研究中，Zeng等[15]發(fā)現(xiàn)NEK2在人前列腺癌細(xì)胞和原發(fā)性前列腺癌組織中表達(dá)升高并與患者的Gleason評(píng)分及病理分期呈正相關(guān)，通過(guò)siRNA技術(shù)沉默NEK2表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞的體外增殖和異種移植體的體內(nèi)生長(zhǎng)。此外，Kokuryo等[16]也發(fā)現(xiàn)NEK2在胰腺癌細(xì)胞株中高表達(dá)，NEK2 siRNA可抑制胰腺癌皮下移植瘤小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)腹腔內(nèi)移植瘤小鼠模型的生存時(shí)間，并利用門(mén)靜脈導(dǎo)管系統(tǒng)有效地阻止肝轉(zhuǎn)移的進(jìn)展。以上結(jié)果表明，NEK2的異常表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，而針對(duì)NEK2的siRNA治療有可能作為腫瘤治療的一個(gè)有效手段。

本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)、qRT-PCR和Western blot檢測(cè)NEK2在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示NEK2蛋白及mRNA在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，并與結(jié)直腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示NEK2可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。為探究NEK2在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制，我們選取結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116作為研究對(duì)象，通過(guò)體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NEK2 siRNA抑制HCT116中NEK2 mRNA表達(dá)。CCK8實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，NEK2干擾后，HCT116細(xì)胞G1期比例增加，S期比例減低，提示出現(xiàn)G0/G1期阻滯，并且細(xì)胞增殖率較對(duì)照組顯著下降。CDK4是細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控因子，它與細(xì)胞cyclin D1形成復(fù)合物后可使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白發(fā)生磷酸化失活，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)展[17]，目前在乳腺癌研究中已發(fā)現(xiàn)NEK2與CDK4的表達(dá)存在分子連接性[18]。NEK2是否通過(guò)與CDK4和cyclin D1的相互作用參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的周期調(diào)控，本研究結(jié)果顯示在NEK2干擾陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組中CDK4和cyclin D1的表達(dá)量顯著降低，表明NEK2下調(diào)可通過(guò)改變CDK4和cyclin D1表達(dá)量使結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。此外Transwell小室法和劃痕實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，NEK2干擾后HCT116細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)及劃痕愈合率均顯著下降，表明NEK2下調(diào)能顯著降低HCT116細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。高度保守的Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)控胚胎發(fā)育、器官形成、組織再生及決定細(xì)胞命運(yùn)方面發(fā)揮著重要作用，而多種腫瘤癌基因則通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路使其異?；罨龠M(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[19-21]。在肝細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)NEK2的異?；罨筛淖?chǔ)?catenin在細(xì)胞內(nèi)定位，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程并獲得侵襲性表型[22]。為研究結(jié)直腸癌中NEK2表達(dá)與EMT機(jī)制的關(guān)系，本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)EMT關(guān)鍵組件E-cadherin和N-cadherin在HCT116細(xì)胞中的變化，結(jié)果顯示敲低NEK2后HCT116細(xì)胞E-cadherin蛋白高表達(dá)，N-cadherin低表達(dá)，表明NEK2在EMT過(guò)程中及結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤促進(jìn)功能上發(fā)揮著關(guān)鍵作用，然而NEK2具體通過(guò)何種信號(hào)通路參與調(diào)控EMT進(jìn)程仍有待進(jìn)一步的研究。

本研究結(jié)果表明，NEK2在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，下調(diào)NEK2表達(dá)可抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，提示NEK2在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，可作為結(jié)直腸癌基因治療的有效靶點(diǎn)。