張冠磊，馬苗苗，蘭文靜，王琳

0 引言

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌類型的80%以上，具有發(fā)病率高、病死率高的特點，近年來發(fā)病率有逐漸升高的趨勢[1]。NSCLC病情隱匿，早期極易誤診或漏診，貽誤病情，使患者失去最佳手術(shù)時機，預后生存期短[2]。因此，了解NSCLC發(fā)生發(fā)展機制，尋找有效干預手段，對患者治療至關(guān)重要。近年來研究表明，NSCLC與多基因、多環(huán)節(jié)異常改變有關(guān)，其中長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,LncRNA）表達調(diào)控與其改變關(guān)系緊密，參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展的多個環(huán)節(jié)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-p21具有抑制胃癌、肺癌等癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用，但具體調(diào)控機制尚不清楚[5-6]。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過表達LncRNA-p21質(zhì)粒載體，上調(diào)A549細胞中LncRNA-p21基因表達，觀察過表達LncRNA-p21基因?qū)549細胞增殖和侵襲等能力的影響及作用機制，為臨床NSCLC靶向治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細胞肺癌A549細胞系購自上海生科院細胞庫；pcDNA-lincRNA-p21、空載質(zhì)粒pcDNA（上海吉瑪公司）；Notch信號通路特異性激活劑Jagged1蛋白（美國R&D Systems公司）；LipofectamineTM2000試劑盒、TRIzol（美國Invitrogen公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）試劑盒（美國Sigma-Aldrich公司）；細胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；一步法實時熒光定量PCR試劑盒（美國QIAGEN公司）；二喹啉甲酸蛋白定量分析試劑盒（美國Thermo公司）；兔抗人Notch1、轉(zhuǎn)錄因子HES-1、Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch 1 intracellular domain,NICD）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）單抗（一抗）、HRP標記二抗（美國Santa Cruz公司）；StepOnePlus Real-Time PCR儀（美國Thermo Fisher公司）；ELx800TS酶標儀（美國BioTek公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 非小細胞肺癌A549細胞置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng)，每兩天換液一次，3～5天傳代1次。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組 取對數(shù)期細胞常規(guī)消化并接種至6孔板，細胞再次貼壁至70%左右時，更換無血清培養(yǎng)基同條件孵育12 h，嚴格按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒操作，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換無雙抗培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)32 h，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞設為過表達組，同法獲得轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA A549細胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞設為空載組，同時取未經(jīng)處理的A549細胞株為對照組。取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達組細胞，加入Jagged1蛋白（終濃度5 mg/L），設為Notch激活劑組。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后LncRNA-p21基因表達檢測 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細胞，胰蛋白酶消化后，離心收集各組細胞，RT-qPCR法檢測各組LncRNA-p21基因表達情況。TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA；根據(jù)SYBR Green PCR試劑盒設定反應體系：SYBR Green PCR buffer 5 μl，10 μmol/L上下游引物各0.2 μl，dNTP酶10.0 μl，ddH2O 4.6 μl；反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性20 s，59℃退火40 s，72℃延伸30 s，重復42個循環(huán)。以內(nèi)參β-actin作對照物，按照2-ΔΔCT計算LncRNA-p21相對表達強度，引物序列見表1。

1.2.4 MTT法檢測各組細胞增殖能力 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載組、過表達組、空白組及Notch激活劑組細胞，調(diào)整細胞密度，以每毫升1×105個接種于96孔板，每組5個復孔。培養(yǎng)至24、48及72 h時，加入20 μl濃度為5 mg/ml MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，傾倒上層培養(yǎng)液，各孔加入DMSO溶液150 μl，混勻后，酶標儀測定570 nm波長處吸光度（A）值。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載組、過表達組、空白組及Notch激活劑組細胞，以每毫升5×104個重新接種于6孔板，每組5個復孔；同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞再次融合完整后，用50 μl無菌槍頭于培養(yǎng)板中間劃直線，移液管吸取細胞培養(yǎng)液輕輕吹洗，確認劃痕邊緣整齊，加入完全培養(yǎng)基，48 h后于倒置顯微鏡下觀察并拍照。細胞遷移率（%）=（初始劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.2.6 Transwell法檢測細胞侵襲能力 收集各組細胞，Transwell小室濾膜由1:6稀釋的DMEM人工基質(zhì)均勻涂布，37℃恒溫培養(yǎng)箱放置40 min左右膠干；下層小室加入培養(yǎng)12 h后的無細胞上清液，上層小室加入培養(yǎng)12 h的單細胞懸液。繼續(xù)孵育48 h后，用手術(shù)鑷取下中間濾膜，置于質(zhì)量分數(shù)3.7%甲醇固定，經(jīng)結(jié)晶紫染色后，于顯微鏡下隨機取5個視野，計數(shù)并統(tǒng)計平均穿膜細胞數(shù)。

1.2.7 Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin基因表達檢測 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載組、過表達組、空白組及Notch激活劑組細胞，調(diào)整細胞密度，以每毫升1×105個接種于96孔板，培養(yǎng)48 h。胰蛋白酶消化后，離心收集各組細胞，RT-qPCR法檢測各組細胞中Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin、Vimentin基因表達情況。TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄法獲得cDNA；嚴格按照SYBR Green PCR試劑盒進行試驗。以2-ΔΔCT計算目的基因的相對表達強度。各基因上下游引物序列見表1。

1.2.8 Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin、和Vimentin蛋白表達檢測 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載組、過表達組、空白組及Notch激活劑組細胞，調(diào)整細胞密度以1×105個/毫升接種于96孔板，培養(yǎng)48 h。胰蛋白酶消化后，離心收集各組細胞，加入0.5 ml細胞裂解液，于冰上裂解20 min，12 000 r/min離心10 min取上清液，BCA試劑盒測定蛋白總量。取50 μg樣品進樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)、封閉，按要求加入稀釋一抗4℃搖床孵育過夜，TBST洗滌3次×5 min后，加入稀釋二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次×5 min，于暗室中顯影、定影，掃描拍照后采用Image J軟件分析各條帶灰度值，蛋白相對表達量用Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin、Vimentin蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件，計量資料均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本間比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞中LncRNA-p21基因表達比較

過表達組、空載組及對照組LncRNA-p21基因相對表達量分別為8.57±1.36、1.07±0.15、1.02±0.14，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=146.674,P<0.001）；過表達組LncRNA-p21基因相對表達量高于空載組和對照組（t=12.257、12.348,均P<0.001）；空載組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.545,P=0.601），見圖1。

2.2 各組細胞增殖情況比較

不同時間四組間MTT實驗A值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；過表達組培養(yǎng)24、48、72 h MTT實驗A值均低于對照組、空載組和Notch激活劑組，Notch激活劑組低于對照組和空載組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對照組與空載組培養(yǎng)24、48、72 h MTT實驗A值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；四組培養(yǎng)48 h MTT實驗A值均高于培養(yǎng)24 h（P<0.05），且培養(yǎng)72 h MTT實驗A值高于48 h（P<0.05），見表2。

圖1 各組細胞中LncRNA-p21基因表達比較Figure l Comparison of LncRNA-p21 gene expression in each group

2.3 各組細胞遷移情況比較

對照組、空載組、過表達組和Notch激活劑組48 h細胞遷移率分別為（71.69±6.20）%、（71.50±6.53）%、（49.32±5.20）%、（63.17±5.92）%，四組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=1 5.5 4 4,P<0.001）；過表達組48 h細胞遷移率低于空載組、對照組和Notch激活劑組（t=6.182、5.941、3.647,均P<0.05），Notch激活劑組低于對照組和空載組（t=2.483、2.367,均P<0.05）；空載組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義（t=0.047,P=0.964），見圖2。

2.4 各組細胞侵襲情況比較

對照組、空載組、過表達組和Notch激活劑組48 h穿膜細胞數(shù)分別為173.33±22.00個、179.00±19.33個、62.33±10.33個、107.00±9.33個，四組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=59.514,P<0.001）；過表達組48 h穿膜細胞數(shù)少于空載組、對照組和Notch激活劑組（t=10.212、11.903、7.176,均P<0.001），Notch激活劑組少于對照組和空載組（t=6.207、7.501,均P<0.001）；空載組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義（t=0.433,P=0.677），見圖3。

表1 Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin、Vimentin基因引物序列Table 1 Primer sequences of Notch1,HES-1,NICD,E-cadherin and Vimentin genes

表2 各組細胞不同時間MTT試驗A值比較Table 2 Comparison of A value of MTT test at different time among each group

2.5 各組Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin的mRNA表達比較

Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin mRNA相對表達量在四組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；過表達組Notch1、HES-1、NICD、Vimentin mRNA相對表達量低于空載組、對照組和Notch激活劑組，Notch激活劑組低于對照組和空載組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；過表達組中E-cadherin mRNA相對表達量高于空載組、對照組和Notch激活劑組，Notch激活劑組高于對照組和空載組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；空載組與對照組間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3。

2.6 各組Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin蛋白表達比較

Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；過表達組Notch1、HES-1、NICD、Vimentin蛋白相對表達量低于空載組、對照組和Notch激活劑組，Notch激活劑組低于空載組和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；過表達組中E-cadherin蛋白相對表達量高于空載組、對照組和Notch激活劑組，Notch激活劑組高于空載組和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；空載組與對照組間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表4、圖4。

圖2 各組劃痕實驗48 h細胞遷移率結(jié)果Figure 2 Cell migration rates of each group at 48 hours detected by scratch test

圖3 Transwell實驗48 h穿膜細胞數(shù)結(jié)果Figure 3 Number of transmembrane cells at 48 hours detected by Transwell test

表3 Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin mRNA相對表達量比較Table 3 Comparison of relative expressions of Notch1,HES-1,NICD,E-cadherin and Vimentin mRNA

圖4 各組蛋白免疫印跡圖Figure 4 Immunoblotting diagrams of proteins in each group

3 討論

近年來，盡管手術(shù)及其他綜合治療手段不斷進步，NSCLC治療成功率有所提高，但仍有部分患者預后不佳，尋找新的治療靶點意義重大。近年來研究表明，LncRNA可通過調(diào)控微小RNA或下游編碼區(qū)RNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，目前已成為腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制相關(guān)研究的熱點[7]。LncRNA-p21在多種惡性腫瘤組織或細胞中異常表達，且與腫瘤增殖、侵襲及遷移相關(guān)[8-9]。Notch信號通路是存在于多種動物體內(nèi)的信號交點通路，在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、細胞增殖、遷移及分化等多種腫瘤生物學活動中發(fā)揮重要調(diào)控作用[10-11]。因此，探討LncRNA-p21能否通過調(diào)控Notch信號通路對NSCLC細胞的EMT過程產(chǎn)生影響，從而影響癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力有重要意義。

本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法上調(diào)A549細胞中LncRNA-p21基因的表達，結(jié)果顯示過表達組LncRNA-p21基因相對表達量高于空載組和對照組，說明成功上調(diào)該基因的表達?；蚪M測序分析顯示，人類基因組非編碼區(qū)存在大量LncRNA，其中約2.4萬個LncRNA參與轉(zhuǎn)錄、干擾、染色質(zhì)修飾等多項生物學活動[12]。Han等[13]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-p21在惡性骨肉瘤組織中表達受到抑制，體外試驗表明，上調(diào)LncRNA-p21表達可抑制骨肉瘤細胞增殖，與本結(jié)果一致。Isin等[14]發(fā)現(xiàn)LncRNA-p21在前列腺癌患者中異常低表達，可作為鑒別診斷前列腺癌和良性前列腺增生的可靠標志物。本研究結(jié)果提示LncRNA-p21基因過表達可抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲能力。

表4 Notch1、HES-1、NICD、E-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量比較Table 4 Comparison of relative expressions of Notch1,HES-1,NICD,E-cadherin and Vimentin protein

本研究結(jié)果顯示，Notch激活劑組A549細胞增殖、遷移及侵襲能力較過表達組增強，Notch1信號通路相關(guān)基因和蛋白表達較過表達組均有上調(diào)，過表達組Notch1信號通路相關(guān)基因和蛋白表達較對照組和空載組均下調(diào)，提示過表達LncRNA-p21基因?qū)Ψ切〖毎伟┑脑鲋?、遷移、侵襲能力的抑制作用可能與抑制Notch信號通路、阻斷A549細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)。人類Notch信號通路主要由Notch受體（1-4）、Notch配體（DSL蛋白）及相關(guān)靶基因HES-1、同型半胱氨酸誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白等組成[15]。Notch1信號通路在多種惡性腫瘤組織中檢測出激活狀態(tài)，參與腫瘤化療耐藥、侵襲及轉(zhuǎn)移過程[16-17]。Notch1信號通路中受體與配體結(jié)合后激活，受體蛋白水解，繼而釋放出NICD易位于細胞核，與核內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄和表達。HES-1是Notch1信號通路下游靶基因，有抑制細胞增殖作用[18-19]。E-cadherin及Vimentin分別是上皮及間質(zhì)標記基因，兩者在維持細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整、細胞間黏附作用等方面起重要作用[20]。研究顯示，活化Notch1片段NICD可誘導轉(zhuǎn)錄性抑制體大量表達，繼而與E-cadherin結(jié)合，增加細胞間接觸抑制從而抑制EMT，抑制細胞侵襲及遷移能力[21]。

綜上，本研究得出LncRNA-p21基因過表達可抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲，其調(diào)控機制可能與抑制Notch信號通路，從而阻斷A549細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)，為臨床通過靶向干擾LncRNA-p21基因表達治療NSCLC提供理論支持。