司怡然，岳健*，劉朝陽(yáng)，李茉，鄭元義，王小兵，袁芃

0 引言

近年來(lái)，免疫治療是腫瘤領(lǐng)域發(fā)展最為迅速的治療手段之一，其本質(zhì)依賴(lài)于激活患者自身的免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗腫瘤。腫瘤疫苗是將腫瘤抗原以多種形式導(dǎo)入患者體內(nèi)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)抗原的細(xì)胞免疫及體液免疫，并能形成長(zhǎng)期的免疫記憶，從而達(dá)到控制或預(yù)防腫瘤的目的[1]。

黑色素瘤是一種惡性程度很高的腫瘤，容易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[2]，同時(shí)黑色素瘤也是一種免疫原性較強(qiáng)的腫瘤[3]，免疫治療的出現(xiàn)在提高黑色素瘤的療效上具有突出的優(yōu)勢(shì)，尤其是免疫系統(tǒng)被激發(fā)后往往能獲得長(zhǎng)期療效及遠(yuǎn)期記憶，因此以腫瘤疫苗為代表的免疫治療在黑色素瘤的預(yù)防及治療中具有良好的應(yīng)用前景。

腫瘤細(xì)胞裂解物（tumor cell lysate,TCL）疫苗是通過(guò)超聲、反復(fù)凍融、機(jī)械勻漿或蛋白分解酶等方法將腫瘤細(xì)胞裂解制備而得。由于TCL中含有大量腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗原及蛋白質(zhì)，可誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗腫瘤作用[4-5]，所以TCL疫苗成為近年來(lái)抗腫瘤免疫治療方面的研究熱點(diǎn)。既往研究表明TCL可誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞活化，如T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞等[6]，但單純的TCL疫苗免疫原性低，僅能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生低水平的免疫應(yīng)答，因此良好的TCL疫苗需搭配合適的佐劑以增強(qiáng)疫苗療效。本研究采用超聲破碎儀獲得B16F10黑色素瘤細(xì)胞TCL，聯(lián)合IL-2為佐劑，制備了一種新型的腫瘤疫苗（TCL+IL-2），擬探討該腫瘤疫苗在小鼠黑色素瘤模型中的預(yù)防和治療作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株及儀器

細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、PBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素/鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Mediatech公司；實(shí)驗(yàn)用重組IL-2購(gòu)自美國(guó)R&D公司；抗凝用肝素及錐蟲(chóng)藍(lán)染液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；抗CD4、抗CD8、抗CD3、抗CD45流式抗體、紅細(xì)胞裂解液及FACS Verse流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；抗CD4、抗CD8免疫組織化學(xué)抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。C57BL/6純系小鼠，雌性，6～8周齡，由北京華阜康生物科技有限公司提供；小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞株為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)室保存。JY96-II超聲破碎儀購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；YA0941細(xì)胞過(guò)濾篩購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。該研究通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批，符合動(dòng)物試驗(yàn)委員會(huì)制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，注冊(cè)號(hào)：NCC2019A196。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將B16F10細(xì)胞凍存管從液氮中取出，37℃水浴鍋中快速融化，10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入9 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基+1%青霉素/鏈霉素混勻，無(wú)菌條件下迅速將溶化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)皿中并混勻，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.2 B16F10-TCL及TCL+IL-2疫苗的制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B16F10細(xì)胞用胰酶37℃消化2 min后，收集全部培養(yǎng)基。1 000 r/min離心3 min，棄上清液。用無(wú)菌PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)/毫升，于2只健康的C57BL/6小鼠右側(cè)腋部皮下接種，每只100 μl。14天后脫頸法處死小鼠，于無(wú)菌條件下剝離腫瘤組織，去除壞死的部分，無(wú)菌沖洗，并于濾網(wǎng)中研磨收集細(xì)胞懸液于10 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min。用無(wú)菌PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×108個(gè)/毫升，分裝至2 ml離心管中。采用超聲破碎儀裂解腫瘤細(xì)胞，超聲條件Φ20變幅桿，工作6 s、停5 s，共3 min，離心管置于裝有碎冰的燒杯中，防止超聲過(guò)程中溫度過(guò)高。超聲結(jié)束后利用錐蟲(chóng)藍(lán)染色明確細(xì)胞是否完全裂解。準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用IL-2，使用ddH2O稀釋至105u/ml備用。取1.5 ml EP管，分別加入50 μl TCL（由5×106個(gè)細(xì)胞裂解得）及50 μl IL-2（含5000 u），混勻后即可使用。

1.2.3 預(yù)防性免疫流程 重新準(zhǔn)備24只雌性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為對(duì)照組（G1）、單純IL-2組（G2）、單純TCL組（G3）、TCL+IL-2疫苗組（G4）。分別于-21d、-14d、-7d左側(cè)腋部皮下注射，共免疫3次。G1組注射100 μl無(wú)菌PBS，G2組注射50 μl IL-2+50 μl無(wú)菌PBS，G3組注射50 μl TCL+50 μl無(wú)菌PBS，G4組注射50 μl TCL+50 μl IL-2。免疫后密切監(jiān)測(cè)小鼠接種部位的局部改變及全身情況。

1.2.4 免疫后小鼠對(duì)側(cè)皮下植瘤 最后一次免疫結(jié)束后1周（d0），在小鼠右側(cè)腋部皮下接種B16F10腫瘤細(xì)胞懸液100 μl（含1×106B16F10細(xì)胞）。植瘤后注意記錄腫瘤的出瘤時(shí)間（以右側(cè)腋下出現(xiàn)可觸及結(jié)節(jié)為準(zhǔn)），出瘤后每3天測(cè)量一次，并記錄腫瘤體積的變化，體積測(cè)量采用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑a（cm）和最短徑b（cm），計(jì)算體積V=1/2（a×b2）。出瘤后2周脫頸法處死小鼠，腫瘤組織剝離，記錄各組小鼠腫瘤的質(zhì)量。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 按照免疫前（-22d）、免疫中（-11d）、植瘤前（0d）、出瘤后（7d）、處死前（14d）的時(shí)間，我們分別對(duì)每組3只小鼠行眼眶后靜脈叢取血，每次取100 μl于肝素抗凝管中。100 μl全血使用2 ml紅細(xì)胞裂解液裂解5 min后，1 000 r/min離心5 min，棄上清并用PBS+10%FBS清洗3次，后用抗CD3、抗CD4、抗CD45及抗CD8避光染色20 min，PBS+10%FBS清洗1次后上機(jī)檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞。d14處死小鼠后我們同時(shí)摘取小鼠脾臟，去除脂肪組織，充分研磨并用紅細(xì)胞裂解液裂解，后用流式細(xì)胞術(shù)抗體避光染色并上機(jī)檢測(cè)脾臟中CD4+T及CD8+T細(xì)胞的表達(dá)。所有流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 腫瘤組織免疫組織化學(xué)染色 小鼠腫瘤組織取出后，用4%多聚甲醛固定，后予石蠟包埋，制片，切片后進(jìn)行腫瘤組織抗CD4、抗CD8免疫組織化學(xué)染色，明確腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞。每只小鼠的腫瘤組織共切片6張行免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下每張切片取5個(gè)視野（×200）拍照，并用ImageJ軟件計(jì)算染色的IOD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞裂解物的活性驗(yàn)證

取小鼠皮下移植瘤研磨為單細(xì)胞懸液，采用超聲破碎儀對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行裂解，錐蟲(chóng)藍(lán)染色明確腫瘤細(xì)胞的裂解情況。無(wú)論是光學(xué)顯微鏡下觀察或是錐蟲(chóng)藍(lán)染色的結(jié)果，超聲作用后均無(wú)完整的細(xì)胞形態(tài)，無(wú)活細(xì)胞存留，見(jiàn)圖1。

2.2 預(yù)防性免疫TCL+IL-2疫苗對(duì)小鼠黑色素瘤的作用

對(duì)四組健康的C57BL/6小鼠進(jìn)行干預(yù)，預(yù)防性免疫流程見(jiàn)圖2A。各組小鼠免疫后局部無(wú)明顯不良反應(yīng)，小鼠全身狀態(tài)良好，各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。植瘤后G1、G2及G3組小鼠首先出瘤，但G4組至植瘤后第7天才有小鼠出瘤，見(jiàn)表1。通過(guò)對(duì)出瘤情況的統(tǒng)計(jì)可見(jiàn)，G4組疫苗作用后明顯推遲了小鼠的出瘤時(shí)間（P=0.034），見(jiàn)圖2B；且G4組的平均腫瘤體積（821.13±1.2）小于其他三組（G1:2591.95±1.0,P=0.023;G2:2007.18±1.5,P=0.031;G3:1899.92±1.4,P=0.029），見(jiàn)圖2C～D。瘤重結(jié)果提示G4組的腫瘤質(zhì)量明顯小于G1組（1.44±0.2vs.2.82±1.3,P=0.0015），見(jiàn)圖2E。

表1 各組小鼠的出瘤時(shí)間Table 1 Onset time of tumor in mice of each group

2.3 外周血及脾臟免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)改變

圖1 超聲破碎儀制備TCL的活性驗(yàn)證 (×40)Figure 1 Activity verification of TCL prepared by ultrasonic disruptor (×40)

圖2 小鼠進(jìn)行預(yù)防性免疫干預(yù)后的出瘤情況Figure 2 Tumor development in each group after preventive immune intervention

動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的變化結(jié)果提示，免疫后各組CD4+T細(xì)胞均有上升，但G4組的CD4+T細(xì)胞在植瘤后有所下降，見(jiàn)圖3A，G1:（11.74±1.0）%;G2:（10.77±1.2）%;G3:（12.89±1.4）%;G4:（10.24±1.9）%。G4組CD8+T細(xì)胞較G1組及G2組均有上升（（16.54±1.0）%vs.G1組:（13.14±1.1）%,P=0.015;G2組:（13.55±1.4）%,P=0.020），見(jiàn)圖3B。此外我們對(duì)脾臟中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及同一天的外周血中CD4+T、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果提示外周血與脾臟的表達(dá)結(jié)果趨勢(shì)大致相同，外周血中G4組CD4+T細(xì)胞較G1組明顯下降（（8.45±0.4）%vs.（14.03±0.2）%,P=0.0089），而G4組及G3組CD8+T細(xì)胞（G4:（19.21±0.2）%;G3:（17.85±0.4）%）表達(dá)較G1組（14.42±0.1）%均上升，且G4組上升更加明顯（P=0.0016）。脾臟流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示G4組CD8+T細(xì)胞表達(dá)較G1組上升（（12.94±0.2）%vs.（10.01±0.1）%,P=0.018），見(jiàn)圖3C～F。

2.4 腫瘤組織免疫細(xì)胞的表達(dá)改變

G4組腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞較其他組減低，而CD8+T細(xì)胞在G4組腫瘤組織中明顯上升（P=0.0078），同時(shí)G3組CD8+T細(xì)胞也較對(duì)照組增加（P=0.032），見(jiàn)圖4。

3 討論

隨著對(duì)免疫學(xué)及腫瘤發(fā)病機(jī)制的逐步深入探討，腫瘤免疫治療成為當(dāng)前最值得期待的研究領(lǐng)域之一。腫瘤疫苗作為免疫治療的重要組成部分之一，近年來(lái)迅速成長(zhǎng)，在基礎(chǔ)研究和臨床研究領(lǐng)域均獲得諸多優(yōu)秀的成果。例如既往基礎(chǔ)研究證實(shí)名為Algenpantucel-L的腫瘤疫苗可以利用排斥反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)腫瘤特異性抗原的攝取，并遷移到區(qū)域淋巴結(jié)以激活CD4+T和CD8+T細(xì)胞。該疫苗的Ⅱ期臨床研究針對(duì)接受了R0或R1手術(shù)切除后胰腺癌患者，Algenpantucel-L治療組的中位和1年無(wú)病生存期分別為21月和62%，1年總生存期為86%[7]，目前該研究的Ⅲ期臨床正在招募中（NCT03165188）。此外，也有諸多應(yīng)用于黑色素瘤的腫瘤疫苗得到驗(yàn)證和發(fā)展[8-9]。TCL疫苗作為腫瘤疫苗的主要類(lèi)型之一，在黑色素瘤的臨床前及臨床研究中的成果并不十分理想，因此TCL疫苗在黑色素瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用仍有較大的探索空間。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠黑色素瘤TCL疫苗，以IL-2為佐劑，兩者的聯(lián)合不僅具有預(yù)防小鼠黑色素瘤發(fā)生的潛力，還可以維持機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間的免疫反應(yīng)來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。IL-2是最早被證明的可以激活T細(xì)胞增長(zhǎng)的細(xì)胞因子之一，是腫瘤疫苗的良好佐劑之選。既往研究證實(shí)低劑量IL-2和腫瘤疫苗聯(lián)用時(shí)將有效增強(qiáng)免疫原性，激發(fā)抗腫瘤作用，同時(shí)有效避免了大劑量的不良反應(yīng)[10]。但另有研究發(fā)現(xiàn)，低劑量IL-2（<1000U）單獨(dú)使用可能還存在損害宿主抗腫瘤的免疫力，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[11-12]。本研究在制定研究計(jì)劃時(shí)，結(jié)合既往的研究結(jié)果，最終證實(shí)IL-2應(yīng)用5 000 u/次皮下注射，小鼠并未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，單純IL-2組的小鼠也未出現(xiàn)明顯的腫瘤增長(zhǎng)。同時(shí)低劑量IL-2聯(lián)合TCL疫苗達(dá)到有效激活抗腫瘤免疫的目的，為低劑量IL-2在腫瘤免疫治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的可能。

圖3 外周血及脾臟流式細(xì)胞術(shù)指標(biāo)變化Figure 3 Changes of CD4 + T and CD8 + T cells in peripheral blood and spleen

腫瘤疫苗可以激發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腫瘤緩解，既往研究發(fā)現(xiàn)可能與CD8+T細(xì)胞有關(guān)，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞幾乎不表達(dá)這類(lèi)MHCⅡ類(lèi)分子[13]。但迄今為止腫瘤疫苗的作用機(jī)制仍無(wú)定論，可能的原因包括腫瘤本身會(huì)產(chǎn)生免疫抑制信號(hào)，可以下調(diào)MHCⅠ類(lèi)分子[14-15]。既往大量研究證實(shí)抗原特異性CD4+T細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞在腫瘤中的募集和浸潤(rùn)，幫助克服腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤作用[16-17]。但也有研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞僅是在誘發(fā)CD8+T細(xì)胞增殖最初的所需[18]，而CD8+T真正發(fā)揮細(xì)胞毒性作用時(shí)并不需要CD4+T細(xì)胞的支持，其輔助功能可能已被激活識(shí)別受體提供的信號(hào)所取代，例如Toll樣受體等[19-20]。因此腫瘤疫苗在引起細(xì)胞毒性殺傷作用并抑制腫瘤生長(zhǎng)的過(guò)程中，CD4+T細(xì)胞承擔(dān)的“角色”值得深入探討。本研究通過(guò)對(duì)小鼠外周血CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞在TCL+IL-2組有明顯上升，單純TCL組也高于單純IL-2組及對(duì)照組。但CD4+T細(xì)胞在各組有所不同，植瘤前各組均有上升，但植瘤后TCL+IL-2組的CD4+T細(xì)胞較其他三組下降。由此我們猜測(cè)TCL+IL-2疫苗發(fā)揮作用的過(guò)程中，CD4+T細(xì)胞只是在免疫初期輔助了CD8+T細(xì)胞的增殖，而當(dāng)后期CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性殺傷功能時(shí)，CD4+T細(xì)胞已不再發(fā)揮作用。此外，我們對(duì)小鼠脾及腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞也進(jìn)行了檢測(cè)，其結(jié)果與外周血中的變化趨勢(shì)基本一致。由此可見(jiàn)CD8+T細(xì)胞的免疫作用是小鼠黑色素瘤TCL+IL-2疫苗發(fā)揮預(yù)防性免疫及抑瘤作用的主要途徑。本研究目前在機(jī)制探索方面的工作仍不夠，后期還需更加深入的探索來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究對(duì)TCL聯(lián)合IL-2疫苗在小鼠黑色素瘤中的作用進(jìn)行探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCL聯(lián)合IL-2通過(guò)激活CD8+T細(xì)胞途徑預(yù)防黑色素瘤發(fā)生，并且有效的抑制腫瘤生長(zhǎng)，為黑色素瘤免疫治療提供了新的研究方向。

圖4 腫瘤組織中免疫指標(biāo)的變化 (×200)Figure 4 Changes of CD4+ T and CD8+ T cells in tumor tissues (×200)